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详细内容

《保健食品及其原料安全性毒理学检验与评价技术指导原则(2020年版)》《保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)》《保健食品理化及卫生指标检验与评价技术指导原则(2020年版)》

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根据《中华人民共和国食品安全法》,经与国家卫生健康委协商一致,市场监管总局制定了《保健食品及其原料安全性毒理学检验与评价技术指导原则(2020年版)》《保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)》《保健食品理化及卫生指标检验与评价技术指导原则(2020年版)》,现予印发,自公告之日起施行。

 

  市场监管总局

  2020年10月16日

  附件:

保健食品及其原料安全性毒理学

检验与评价技术指导原则2020年版)

 

1 依据

本指导原则依据食品安全国家标准GB 15193系列标准制定。

2 范围

本指导原则适用于保健食品及其原料的安全性毒理学的检验与评价。

3 受试物

3.1 受试物为保健食品或保健食品原料。

3.2 资料要求

3.2.1 应提供受试物的名称、性状、规格、批号、生产日期、保质期、保存条件、申请单位名称、生产企业名称、配方、生产工艺、质量标准、保健功能以及推荐摄入量等信息。

3.2.2 受试物为保健食品原料时应提供动物和植物类原料的产地和食用部位、微生物类原料的分类学地位和生物学特征、食用条件和方式、食用历史、食用人群等基本信息,以及其他有助于开展安全性评估的相关资料。

3.2.3 原料为从动物、植物、微生物中分离的成分时,还需提供该成分的含量、理化特性和化学结构等资料。

3.2.4 提供受试物的主要成分、功效成分/标志性成分及可能含有的有害成分的分析报告。

3.3 受试物的特殊要求

3.3.1 保健食品应提供包装完整的定型产品。毒理学试验所用样品批号应与功能学试验所用样品批号一致,并且为卫生学试验所用三批样品之一(益生菌、奶制品等产品保质期短于整个试验周期的产品除外)。根据技术审评意见要求补做试验的,若原批号样品已过保质期,可使用新批号的样品开展试验,但应提供新批号样品按产品技术要求检验的全项目检验报告。

3.3.2 由于推荐量较大等原因不适合直接以定型产品进行试验时,可以对送检样品适当处理,如浓缩等。为满足安全倍数要求,可去除部分至全部辅料,如去除辅料后仍未达到安全倍数要求,可部分去除已知安全的食品成分等。应提供受试样品处理过程的说明和相应的证明文件,处理过程应与原保健食品的主要生产工艺步骤保持一致。

4 毒理学试验的主要项目

依据食品安全国家标准GB 15193的相关评价程序和方法开展下列试验。

4.1 急性经口毒性试验

4.2 遗传毒性试验:细菌回复突变试验,哺乳动物红细胞微核试验,哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验,小鼠精原细胞或精母细胞染色体畸变试验,体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验,体外哺乳类细胞TK基因突变试验,体外哺乳类细胞染色体畸变试验啮齿类动物显性致死试验,体外哺乳类细胞DNA损伤修复(非程序性DNA合成)试验,果蝇伴性隐性致死试验。

遗传毒性试验组合:一般应遵循原核细胞与真核细胞、体内试验与体外试验相结合的原则,并包括不同的终点(诱导基因突变、染色体结构和数量变化),推荐下列遗传毒性试验组合:

组合一:细菌回复突变试验;哺乳动物红细胞微核试验或哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验;小鼠精原细胞或精母细胞染色体畸变试验或啮齿类动物显性致死试验。

组合二:细菌回复突变试验;哺乳动物红细胞微核试验或哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验;体外哺乳类细胞染色体畸变试验或体外哺乳类细胞TK基因突变试验。

根据受试物的特点也可用其他体外或体内测试替代推荐组合中的一个或多个体外或体内测试。

4.3 28天经口毒性试验

4.4 致畸试验

4.5 90天经口毒性试验

4.6 生殖毒性试验

4.7 毒物动力学试验

4.8 慢性毒性试验

4.9 致癌试验

4.10 慢性毒性和致癌合并试验

5 毒性试验的选择

5.1 保健食品原料

需要开展安全性毒理学检验与评价的保健食品原料,其试验的选择应参照新食品原料毒理学评价有关要求进行。

5.2 保健食品

5.2.1 保健食品一般应进行急性经口毒性试验、三项遗传毒性试验和28天经口毒性试验。根据实验结果和目标人群决定是否增加90天经口毒性试验、致畸试验和生殖毒性试验、慢性毒性和致癌试验及毒物动力学试验。

5.2.2 以普通食品为原料,仅采用物理粉碎或水提等传统工艺生产、食用方法与传统食用方法相同,且原料推荐食用量为常规用量或符合国家相关食品用量规定的保健食品,原则上可不开展毒性试验。

5.2.3 采用导致物质基础发生重大改变等非传统工艺生产的保健食品,应进行急性经口毒性试验、三项遗传毒性试验、90天经口毒性试验和致畸试验,必要时开展其他毒性试验。

6 特定产品的毒理学设计要求

6.1 针对产品配方中含有人体必需营养素或已知存在安全问题的物质的产品,如某一过量摄入易产生安全性问题的人体必需营养素(如维生素A、硒等)或已知存在安全问题物质(如咖啡因等),在按其推荐量设计试验剂量时,如该物质的剂量达到已知的毒性作用剂量,在原有剂量设计的基础上,应考虑增设去除该物质或降低该物质剂量(如降至未观察到有害作用剂量)的受试物剂量组,以便对受试物中其他成分的毒性作用及该物质与其他成分的联合毒性作用做出评价。

6.2 推荐量较大的含乙醇的受试物,在按其推荐量设计试验剂量时,如超过动物最大灌胃容量,可以进行浓缩。乙醇浓度低于15V/V的受试物,浓缩后应将乙醇恢复至受试物定型产品原来的浓度。乙醇浓度高于15的受试物,浓缩后应将乙醇浓度调整至15,并将各剂量组的乙醇浓度调整一致。不需要浓缩的受试物,其乙醇浓度高于15时,应将各剂量组的乙醇浓度调整至15。在调整受试物的乙醇浓度时,原则上应使用生产该受试物的酒基。

6.3 针对适宜人群包括孕妇、乳母或儿童的产品,应特别关注是否存在生殖毒性和发育毒性,必要时还需检测某些神经毒性和免疫毒性指标。

6.4 有特殊规定的保健食品,应按相关规定增加相应的试验,如含有益生菌、真菌等,应当按照《保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则》开展相关试验。

7 动物实验设计共性问题

7.1 受试物的前处理

7.1.1 袋泡茶类受试物的提取方法应与产品推荐饮用的方法相同,可用该受试物的水提取物进行试验。如果产品无特殊推荐饮用方法,水提取物可采用以下提取条件进行:常压、温度8090,浸泡时间30 min,水量为受试物质量的10倍或以上,提取2次,将提取液合并浓缩至所需浓度,并标明该浓缩液与原料的比例关系。如产品有特殊推荐服用方法(如推荐食用浸泡后的产品),在毒理学试验设计时应予以考虑。

7.1.2 液体受试物需要进行浓缩处理时,应采用不破坏其中有效成分的方法。可使用温度6070 减压或常压蒸发浓缩、冷冻干燥等方法。液体受试物经浓缩后达到人体推荐量的试验要求,如不能通过灌胃给予的,容许以掺入饲料的方式给予实验动物。

7.1.3 不易粉碎的固体受试物(如蜜饯类和含胶基的受试物)可采用冷冻干燥后粉碎的方式处理,并在试验报告中详细说明。

7.1.4 含益生菌或其他微生物的受试物在进行细菌回复突变试验或体外细胞试验时,应将微生物灭活,并说明具体方法。

7.1.5 对人体推荐量较大的受试物,在按其推荐量设计试验剂量时,如超过动物的最大灌胃容量或超过掺入饲料中的限量(10w/w)),可允许去除无安全问题的部分至全部辅料或已知安全的食品成分进行试验,并在试验报告中详细说明。

7.1.6 吸水膨胀率较高的受试物应考虑受试物吸水膨胀后对给予剂量和实验动物的影响,应选择合适的受试物给予方式(灌胃或掺入饲料)。如采用灌胃方式给予,应选择水为溶媒。

7.2 受试物的给予方式

7.2.1 受试物应经口给予。根据受试物的性质及人体推荐摄入量,选择掺入饲料或饮水、灌胃的方式给予受试物。应详细说明受试物配制方法、给予方法和时间。

7.2.2 灌胃给予受试物时,应根据试验的特点和受试物的理化性质选择适合的溶媒(溶剂、助悬剂或乳化剂),将受试物溶解或悬浮于溶媒中。溶媒一般可选用蒸馏水、纯净水、食用植物油、食用淀粉、明胶、羧甲基纤维素、蔗糖脂肪酸酯等,如使用其他溶媒应说明理由。所选用的溶媒本身应不产生毒性作用;与受试物各成分之间不发生化学反应,且保持其稳定性;无特殊刺激性或气味。

7.2.3 掺入饲料或饮水方式给予受试物时,应保证受试物的稳定性、均一性及适口性,以不影响动物摄食、饮水量和营养均衡为原则。当受试物在饲料中的加入量超过5w/w)时,需考虑动物的营养需要,结合受试物的蛋白质含量将各组饲料蛋白质水平调整一致,并说明具体调整方法。饲料中添加受试物的比例最高不超过10w/w)。

7.3 实验动物的选择

实验动物应符合相应国家标准的要求,同时结合保健功能(如辅助改善记忆、缓解体力疲劳等)的特点选择适当的实验动物的品系、性别和年龄等。

8 试验结果的判定与应用

8.1 急性毒性试验

8.1.1 原料

LD50小于人的推荐(可能)摄入量的100倍,则一般应放弃该受试物作为保健食品原料,不再继续进行其他毒理学试验。

8.1.2 保健食品

8.1.2.1 LD50小于人的可能摄入量的100倍,则放弃该受试物作为保健食品。如LD50大于或等于100倍者,则可考虑进入下一阶段毒理学试验。

8.1.2.2 如动物未出现死亡的剂量大于或等于10g/kg·BW(涵盖人体推荐量的100倍),则可进入下一阶段毒理学试验。

8.1.2.3 对人的可能摄入量较大和其它一些特殊原料的保健食品,按最大耐受量法给予最大剂量动物未出现死亡,也可进入下一阶段毒理学试验。

8.2 遗传毒性试验

8.2.1 如三项试验均为阴性,则可继续进行下一步的毒性试验。

8.2.2 如遗传毒性试验组合中两项或以上试验阳性,则表示该受试物很可能具有遗传毒性和致癌作用,一般应放弃该受试物应用于保健食品。

8.2.3 如遗传毒性试验组合中一项试验为阳性,根据其遗传毒性终点、结合受试物的结构分析、化学反应性、生物利用度、代谢动力学、靶器官等资料综合分析,再选两项备选试验(至少一项为体内试验)。如再选的试验均为阴性,则可继续进行下一步的毒性试验;如其中有一项试验阳性,则应放弃该受试物应用于保健食品。

8.3 28天经口毒性试验

对只需要进行急性毒性、遗传毒性和28天经口毒性试验的受试物,若试验未发现有明显毒性作用,综合其他各项试验结果可做出初步评价;若试验发现有明显毒性作用,尤其是存在剂量-反应关系时,应放弃该受试物用于保健食品。

8.4 90天经口毒性试验

根据试验所得的未观察到有害作用剂量进行评价,原则是:

a)未观察到有害作用剂量小于或等于人的推荐(可能)摄入量的100倍表示毒性较强,应放弃该受试物用于保健食品。

b)未观察到有害作用剂量大于100倍而小于300倍者,应进行慢性毒性试验。

c)未观察到有害作用剂量大于或等于300倍者则不必进行慢性毒性试验,可进行安全性评价。

8.5 致畸试验

根据试验结果评价受试物是否为该实验动物的致畸物。若致畸试验结果阳性则不再继续进行生殖毒性试验和生殖发育毒性试验。在致畸试验中观察到的其他发育毒性,应结合28天和(或)90天经口毒性试验结果进行评价,必要时进行生殖毒性试验和生殖发育毒性试验。

8.6 生殖毒性试验和生殖发育毒性试验

根据试验所得的未观察到有害作用剂量进行评价,原则是:

a)未观察到有害作用剂量小于或等于人的推荐(可能)摄入量的100倍表示毒性较强,应放弃该受试物用于保健食品。

b)未观察到有害作用剂量大于100倍而小于300倍者,应进行慢性毒性试验。

c)未观察到有害作用剂量大于或等于300倍者则不必进行慢性毒性试验,可进行安全性评价。

8.7 慢性毒性和致癌试验

8.7.1 根据慢性毒性试验所得的未观察到有害作用剂量进行评价的原则是:

a)未观察到有害作用剂量小于或等于人的推荐(可能)摄入量的50倍者,表示毒性较强,应放弃该受试物用于保健食品。

b)未观察到有害作用剂量大于50倍而小于100倍者,经安全性评价后,决定该受试物可否用于保健食品。

c)未观察到有害作用剂量大于或等于100倍者,则可考虑允许使用于保健食品。

8.7.2 根据致癌试验所得的肿瘤发生率、潜伏期和多发性等进行致癌试验结果判定的原则是(凡符合下列情况之一,可认为致癌试验结果阳性。若存在剂量-反应关系,则判断阳性更可靠):

a)肿瘤只发生在试验组动物,对照组中无肿瘤发生。

b)试验组与对照组动物均发生肿瘤,但试验组发生率高。

c)试验组动物中多发性肿瘤明显,对照组中无多发性肿瘤,或只是少数动物有多发性肿瘤。

d)试验组与对照组动物肿瘤发生率虽无明显差异,但试验组中发生时间较早。

致癌试验结果阳性应放弃将该受试物用于保健食品。

9 安全性综合评价时需要考虑的因素

9.1 试验指标的统计学意义、生物学意义和毒理学意义

对实验中某些指标的异常改变,应根据试验组与对照组指标是否有统计学差异、是否存在剂量-反应关系、同类指标结果的一致性、不同性别结果的一致性、与受试物声称的保健功能的关联以及本实验室的历史性对照值范围等,综合考虑指标差异有无生物学意义,并进一步判断是否具有毒理学意义。此外,如在受试物组发现某种在对照组没有发生的肿瘤,即使与对照组比较无统计学意义,仍要给予关注。

9.2 人体推荐(可能)摄入量较大的受试物

一方面,若受试物掺入饲料的最大加入量(原则上最高不超过饲料的10)或液体受试物经浓缩后仍达不到未观察到有害作用剂量为人体推荐(可能)摄入量的规定倍数时,综合其他毒性试验结果和实际人体食用或饮用量进行安全性评价。另一方面,应考虑给予受试物量过大时,可能通过影响营养素摄入量及其生物利用率从而导致某些与受试物无关的毒理学表现。

9.3 时间-毒性效应关系

对由受试物引起实验动物的毒性效应进行分析评价时,要考虑在同一剂量水平下毒性效应随时间的变化情况。

9.4 人群资料

由于存在着动物与人之间的物种差异,在评价保健食品及其原料的安全性时,应尽可能收集人群接触受试物后的反应资料。人体的毒物动力学或代谢资料对于将动物试验结果推论到人体具有很重要的参考意义。

9.5 动物毒性试验和体外试验资料

本程序所列的各项动物毒性试验和体外试验系统是根据目前管理(法规)毒理学规定所得到的重要资料,也是进行安全性评价的主要依据。结合其他来源于计算毒理学、体外试验或体内试验的相关资料,有助于更加全面地解释实验结果做出科学的评价。

9.6 不确定系数

即安全系数。将动物毒性试验结果外推到人时,鉴于动物与人的物种和个体之间的生物学差异,不确定系数通常为100,但可根据受试物的原料来源、理化性质、毒性大小、代谢特点、蓄积性、接触的人群范围、保健食品及其原料中的使用量和人的可能摄入量、使用范围及功能等因素来综合确定其安全系数的大小。

9.7 毒物动力学试验的资料

毒物动力学试验是对化学物质进行毒理学评价的一个重要方面,因为不同化学物质及剂量大小,在毒物动力学或代谢方面的物种差别往往对毒性作用影响很大。在毒性试验中,原则上应尽量使用与人具有相同毒物动力学或代谢模式的动物品系来进行试验。研究受试物在实验动物和人体内吸收、分布、排泄和生物转化方面的差别,对于将动物试验结果外推到人和降低不确定性具有重要意义。

10 保健食品安全性的重新评价 

安全性评价的依据不仅仅是安全性毒理学试验的结果,而且与当时的科学水平、技术条件以及社会经济、文化因素有关。因此,随着时间的推移,社会经济的发展、科学技术的进步,当对原料或产品的安全性研究有新的科学认识时,应结合产品上市后人群食用过程中发现的安全问题以及管理机构采取的与安全有关的管理措施,对产品的安全性进行重新评价。

 

 

 

 

 

 

 

保健食品原料用菌种安全性

检验与评价技术指导原则2020年版)

 

1 范围

本指导原则规定了保健食品原料用细菌、丝状真菌(子实体除外)和酵母的安全评价中的致病性(毒力)检验与评价程序和方法。

本指导原则适用于保健食品原料用菌种(包括保健食品配方用及原料生产用菌种)的致病性检验与评价。

本指导原则不适用于基因改造微生物菌种和在我国无使用习惯的菌种致病性检验与评价

2 术语和定义

2.1 致病性,Pathogenicity

微生物感染宿主造成健康损害引起疾病的能力。

2.2 产毒能力,Toxigenicity

微生物产生对人和动物有毒作用的活性代谢产物的能力。

2.3 毒性,Toxicity

微生物及其代谢产物对机体可能造成的潜在伤害(不良反应)。

3 对拟评价微生物菌种需提交的基本资料要求

在进行致病性评价验前,菌种送检单位需提供以下资料供评价单位审核。

3.1 基本信息

拟评价菌种名称(包括学名、俗名、曾用名、拉丁名等)、来源及用途。

3.2 菌种分类学资料

提供由有菌种鉴定资质的机构出具的对拟评价菌种的规范、科学的分类学(属、种名称及株)资料。细菌的分类和命名应遵循原核生物分类学国际委员会(International Committee on Systematics of Prokaryotes)的规定,并符合原核生物国际命名法规(International Code of Nomenclature of Prokaryotes)要求。真菌的分类和命名应按国际藻类、真菌和植物命名法规(International Code of Nomenclature for algae, fungi, and plants)进行。

3.3 菌种鉴定资料

根据目前已有的知识,提供基于表型及基因测序技术鉴定到种水平的资料。作为保健食品的功效成分(活菌),应提供鉴定到株水平的资料。

3.4 菌种生长环境条件资料

提供拟评价菌种生长最适培养基及培养条件(培养时间、培养温度和湿度、光照等),以及菌种保藏及复壮方法等相关资料。

3.5 诱变菌种

经过诱变的菌种还需提供详细的菌种诱变方法(包括使用的诱变剂、诱变条件及诱变验流程等)和不少于100代(传代间隔不少于7天)的遗传稳定性研究报告。

3.6 生产相关信息

包括但不限于拟评价菌安全用于保健食品的生产记录、工艺流程、企业标准等资料。

3.7 国内外安全性评价资料综述

基于国内外文献数据,提供拟评价菌的国内外使用历史和安全性评价资料,包括其致病性和产毒能力的报告、研究文献或综述等;若无拟评价菌的上述资料,应提供在亲缘关系上与其相近种属的安全性评价资料。

3.8 其他国家批准资料

    提供其他国家已批准拟评价作为膳食补充剂、功能食品或普通食品生产使用的相关证明资料。

3.9 其他需要说明的信息。

4 评价方法

对已经提供以上资料的拟评价菌,可以按照以下方法开展评价。

4.1 全基因组测序(Whole Genome Sequencing, WGS

4.1.1 基因测序

对拟评价菌株进行全基因组测序,分别获得其基因组完成图框架图,测序报告应包括(但不限于)以下信息:

- DNA提取方法

- 测序方案及仪器设备

- 序列组装方法

- 序列质量评价

- FASTA文件

- 与预期基因组大小相关的重叠群(Contigs总长度

- 基因注释流程

- 对真菌而言,还需提供从相关数据库中获得的全基因组注释质量信息。

4.1.2 基因序列分析

将拟评价菌株的基因组序列与已有的数据库,包括但不限于毒力基因数据库(VFDB)、毒力/致病岛数据库(PAIDB)、生物防御数据库(MvirDB)等最新版本中存储的序列进行比对,并分析拟评价菌株遗传物质中与致病明确相关的已知毒力因子和毒素代谢相关基因的存在情况。应提供包括(但不限于)以下信息的分析报告:

- 毒力/致病性(或产毒)相关基因名称、所在位置、与最新数据库中已有毒力基因的匹配度等信息

- 编码的蛋白及序列号

- 毒力/致病因子(毒素产生、侵袭和粘附因子等)

- 序列长度覆盖度≥60%

- 输入序列与数据库中序列的匹配度(≥85%)和e值(<10-5

- 数据库中已有的菌株名称

- 基因组图谱

- 拟评价的真菌菌株还应根据文献报道能够产生的毒素类别,针对性检索是否存在毒素合成关键基因及其基因簇

4.2 动物致病性试验

由具备菌种致病性检和评价资质的机构,分别按照附录A、附录B和附录C规定的试验方案对拟评价的保健食品用细菌、丝状真菌、酵母菌株开展致病性对结果做出评价并出具报告。

4.3 产毒试验

对某些能够产生毒素的微生物,应在多种基质和条件下(单品种固体、多品种固体复合、不同成分液体组合等)进行产毒试验,并按照国家标准检测方法或国际组织/相关国家规定的标准检测方法进行有毒活性代谢产物含量检测。

5 结果判定

5.1 满足以下所有条件者,可用于保健食品。

5.1.1 动物验显示无致病性

5.1.2 产毒验结果显示,在受试的任何一种基质中均不产生有毒活性代谢产物

5.1.3 根据现有知识,全基因组序列分析未发现存在已知的毒力/致病基因(或毒素合成关键基因及其基因簇)。

5.2 全基因组序列中发现含有已知毒力/致病基因(或毒素合成关键基因及其基因簇),但动物试验显示不具有致病性、或产毒验检测到已知的有毒活性代谢产物但其水平较低,长期摄入对人体健康无影响,结合国内外使用历史,可用于保健食品

5.3 动物试验显示具有致病性,或产生高水平已知有毒代谢产物,长期摄入可能影响人体健康,不能用于保健食品。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

附录A

(规范性附录)

    保健食品原料用细菌致病性检验方法

1 范围

    本方法规定了保健食品原料用细菌的致病性验方法。

    本方法适用于保健食品原料用细菌的致病性检验

2 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌和培养设备外,其他设备与材料如下:

2.1 恒温培养箱:36℃±1℃

2.2 离心机离心力33000  g

2.3 电子天平:感量0.1 g 0.001 g

2.4 比浊仪。

2.5 温湿度计。

2.6 显微镜:10×100×

2.7 厌氧培养装置:厌氧罐、厌氧箱。

2.8 无菌锥形瓶:容量100 mL500 mL

2.9 无菌吸管:1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)。

2.10 无菌试管:16 mm×160 mm

2.11 无菌培养皿:直径90 mm

2.12 无菌量筒:容量100 mL

2.13 微量移液器及配套枪头:量程为100 μL1000 μL

2.14 注射器:量程为100 μL1000 μL

2.15 小鼠灌胃针头。

3 培养基和试剂

3.1 无菌生理盐水:商品化的生理盐水或8.5 g NaCl溶于1000 mL蒸馏水中,分装后121℃高压灭菌15 min,备用。

3.2 LB肉汤培养基:商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,121℃高压灭菌15 min,备用。

3.3 LB琼脂平板:商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,121℃高压灭菌15 min,制备LB琼脂平板,备用。

3.4 半胱氨酸盐酸盐储备液:称取500 mg半胱氨酸盐酸盐于50 mL无菌离心管中,加入10 mL蒸馏水,充分溶解后用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后备用。

3.5 含有半胱氨酸盐酸盐的MRS肉汤培养基:商品化MRS肉汤培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,121℃高压灭菌15 min,待培养基冷却至50℃右时,加入按3.4制备的半胱氨酸盐酸盐储备液,使培养基中半胱氨酸盐酸盐的终浓度为500 μg/mL,备用。

3.6 含有半胱氨酸盐酸盐MRS琼脂平板:商品化MRS琼脂培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,121℃高压灭菌15 min,待培养基冷却至50℃左右时,加入按3.4制备的半胱氨酸盐酸盐储备液,使培养基中半胱氨酸盐酸盐的终浓度为500 μg/mL,用于制备含有半胱氨酸盐酸盐的MRS琼脂平板。

3.7 含有半胱氨酸盐酸盐的双歧杆菌琼脂平板:商品化双歧杆菌琼脂培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,121℃高压灭菌15 min,待培养基冷却至50℃左右时,加入3.4中制备的半胱氨酸盐酸盐储备液,使半胱氨酸盐酸盐的终浓度为500 μg/mL,用于制备含有半胱氨酸盐酸盐的双歧杆菌琼脂平板。

4 实验动物

选用SPF级昆明或ICR健康成年小鼠,雌雄各半,体重范围为18.0 g22.0 g

5 操作步骤

    所有拟评价的菌株必须使用腹腔注射和经口灌胃两种途径给予动物受试物以评价不同受试物暴露途径对动物的致病性

5.1 腹腔注射

5.1.1 菌株活化

目前我国已批准的可用于保健食品的细菌主要是双歧杆菌和乳杆菌除这两个属以外的其他新申报菌种在以下描述中均使用其他细菌

根据送检菌株的保存状态,将双歧杆菌和乳杆菌首先接种含有半胱氨酸盐酸盐的MRS肉汤、其他细菌接种LB肉汤或适于该菌生长的最适液体培养基中,并置适宜的培养条件下(包括培养温度、湿度,厌氧、需氧、微需氧等)培养一定时间(培养时间长短视不同菌种而异)

5.1.2 菌悬液制备

5.1.1中活化的双歧杆菌接种含有半胱氨酸盐酸盐的MRS琼脂平板或含有半胱氨酸盐酸盐的双歧杆菌琼脂平板(乳杆菌接种含有半胱氨酸盐酸盐的MRS琼脂平板,其他细菌接种LB琼脂平板或适应于该菌生长的最适培养基琼脂平板),在规定的适宜培养条件下(包括培养温度、湿度,厌氧、需氧、微需氧等)培养一定时间(培养时间长短视不同菌种而异)后,刮取平板上的菌落,将其悬浮于无菌生理盐水中,充分混匀后,用适量无菌生理盐水调整菌悬液浓度并比浊,使最终菌悬液中的菌浓度达到5.0×107 CFU/mL,用于小鼠腹腔注射。

5.1.3 注射

小鼠不少于40只,雌雄各半,随机分成4组(每组不少于10只),包括雄性小鼠无菌生理盐水对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠无菌生理盐水对照组、雌性小鼠菌悬液组。每只小鼠注射0.2 mL,即受试物组每只小鼠注射菌量不少于1.0×107 CFU

5.1.4 观察

动物腹腔注射后每天观察1次,至少连续观察21 d

观察并记录小鼠皮肤和毛、眼睛和粘膜、呼吸情况、肢体活动、行为方式等有无异常。特别注意观察是否出现振颤、抽搐、腹泻、嗜睡、流涎和昏迷等现象。验前称量并记录所有小鼠的体重,验结束后称量并记录所有存活小鼠的体重。对于验期间死亡的小鼠,尽可能精确记录小鼠的死亡时间,同时称重并记录。

5.2 经口灌胃

5.2.1 菌数预估

无菌吸取上述5.1.1的培养液,分别加至两个无菌离心管中,每管1 mL3000  g 离心10 min,弃去上清液后,用适量无菌生理盐水调整菌悬液浓度并比浊,使最终菌悬液中菌的浓度分别不低于2.5×108 CFU/mL1.25×109 CFU/mL,并分别记录每mL培养液离心后所得沉淀物中细菌数调整至2.5×108 CFU/mL1.25×109 CFU/mL时需加入的无菌生理盐水的体积(mL)。

5.2.2 菌悬液制备

5.2.2.1 培养上清液的制备

根据受试动物总数和每只动物的灌胃体积计算所需要的受试菌株培养液用量。吸取5.1.1培养液,将培养液一分为二3000  g 各离心10 min后,将上清液分别转至100 mL无菌量筒中,一份上清液用于菌悬液原液的制备,另一份上清液冷冻浓缩至原体积的五分之一,作为5倍浓缩上清液,备用。

5.2.2.2 菌悬液原液的制备

按照5.2.1中获得的细菌终浓度达到2.5×108 CFU/mL所需要的生理盐水体积,根据离心的培养物体积,按相同比例加入5.2.2.1获得的上清液,调整离心后的沉淀物使其细菌数达到2.5×108 CFU/mL(上清液量不够时可用空白培养基补齐)。

5.2.2.3浓缩菌悬液的制备

按照5.2.1中获得的细菌终浓度达到1.25×109 CFU/mL所需要的生理盐水体积,根据离心的培养物体积,按相同比例加入5.2.2.1获得的5倍浓缩上清液,调整离心后的沉淀物使其细菌数达到1.25×109 CFU/mL

5.2.3 灌胃

小鼠不少于80只,雌雄各半,分别随机分成8组(每组不少于10只),包括雄性小鼠培养基对照组、雄性小鼠菌悬液组、雄性小鼠5倍浓缩培养基对照组、雄性小鼠5倍浓缩菌悬液组;雌性小鼠培养基对照组、雌性小鼠菌悬液组、雌性小鼠5倍浓缩培养基对照组、雌性小鼠5倍浓缩菌悬液组。各组均以20 mL/kg·BW的体积给小鼠灌胃,连续灌胃3 d,首次灌胃前小鼠应禁食过夜(16 h),灌胃后3 h4 h喂食。

5.2.4 观察

动物经口灌胃后每天观察1次,至少连续观察21 d,观察指标同5.1.4

6 结果与报告

5.15.2的动物验结果进行统计学分析和综合评价,包括:

1受试物对动物一般健康情况有无不良影响

2受试物对动物体重等指标的影响

3受试物组动物死亡情况

4若受试物组动物在验期间未出现中毒症状或死亡,且体重等指标与对照组相比差异无统计学意义,即可判定该菌无致病性;若受试物组动物在验期间出现中毒症状或死亡,或验期间体重等指标与对照组相比有显著性差异,即可判定该菌具有致病性。


附录B

(规范性附录)

    保健食品原料用丝状真菌的致病性验方法

1 范围

    本方法规定了保健食品原料用丝状真菌的致病性验方法。

    本方法适用于保健食品原料用丝状真菌的致病性检验

2 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:

2.1 恒温培养箱:28℃±1℃

2.2 电子天平:感量为0.1 g

2.3 锥形瓶:容量为500 mL

2.4 无菌吸管:1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)。

2.5 显微镜:10×100×

2.6 微量移液器及配套枪头:量程为100 μL1000 μL

2.7 血球计数板。

2.8 注射器:量程为100 μL1000 μL

2.9 小鼠灌胃针头。

2.10 温湿度计。

2.11 接种钩。

2.12 球磨仪或功能相当的仪器

2.13 无菌培养皿:直径90 mm

3 培养基和试剂

3.1 麦芽汁琼脂平板:商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,121℃高压灭菌15 min,制备麦芽汁琼脂平板,备用。

3.2 马铃薯葡萄糖琼脂平板:商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,121℃高压灭菌15 min,制备马铃薯葡萄糖琼脂平板,备用。

3.3 无菌生理盐水:商品化的生理盐水或8.5 g NaCl溶于1000 mL蒸馏水中,分装后121℃高压灭菌15 min,备用。

如拟评价菌株在上述两种培养基上的生长状态和产孢子量均不理想,可选用适于该菌株生长和产孢的其他培养基。

4 实验动物

选用SPF级昆明或ICR健康小鼠,雌雄各半,体重范围为18.0 g22.0 g

5 操作步骤

    所有拟评价菌株必须使用腹腔注射和经口灌胃两种途径给予动物受试物以评价不同受试物暴露途径对动物的致病性

5.1 腹腔注射

5.1.1 菌悬液制备

5.1.1.1 产孢子量大的菌株:将拟评价菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板(红曲霉属菌株接种麦芽汁琼脂平板)或适于拟评价菌株生长的培养基平板,28℃±1℃培养7 d14 d后,挑取平板上的孢子,将其悬浮于无菌生理盐水中,充分混匀后,用血球计数板计数孢子浓度,并用适量无菌生理盐水调整,使其最终浓度不低于5.0×107 CFU/mL

5.1.1.2 产孢子量少或不产孢子的菌株:将拟评价菌株接种于适宜的培养基上, 28℃±1℃下培养7 d14 d或在适宜的诱导产孢条件下培养一定时间后,挑取平板的菌丝体及孢子,用球磨仪(或其他功能相当的仪器)将菌丝体磨碎,生理盐水重悬后,用血球计数板计数,并用适量无菌生理盐水调整,使菌悬液中菌丝体片段数/孢子的最终浓度不低于5.0×107 CFU/mL

5.1.2 注射

小鼠不少于40只,雌雄各半,分别随机分成4组(每组不少于10只),包括雄性小鼠生理盐水对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠生理盐水对照组、雌性小鼠菌悬液组,每只小鼠注射0.2 mL,即受试物组每只小鼠注射的菌量不少于1.0×107 CFU

5.1.3 观察

动物腹腔注射后每天观察1次,至少连续观察21 d,观察指标同附录A中的5.1.4

5.2 经口灌胃

5.2.1 菌悬液制备

除制备的菌悬液中真菌孢子/菌丝体片段的浓度不低于2.5×108 CFU/mL外,其他操作步骤同5.1.1

5.2.2 灌胃

小鼠不少于40只,雌雄各半,分别随机分成4组(每组不少于10只),包括雄性小鼠生理盐水对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠生理盐水对照组、雌性小鼠菌悬液组,各组均以20 mL/kg·BW的体积给小鼠灌胃1次,灌胃前禁食过夜(16 h),灌胃后3 h4 h喂食。

5.2.3 观察

动物经口灌胃后每天观察1次,至少连续观察21 d,观察指标同附录A中的5.1.4

6 结果与报告

5.15.2的动物验结果进行统计学分析和综合评价,内容同附录A中的条款6


附录C

(规范性附录)

    保健食品原料用酵母的致病性验方法

1 范围

    本方法规定了保健食品原料用酵母的致病性验方法。

    本方法适用于保健食品原料用酵母的致病性检验

2 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:

2.1 恒温培养箱:28℃±1℃

2.2 电子天平:感量为0.1 g

2.3 锥形瓶:容量为500 mL

2.4 无菌吸管:1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)。

2.5 显微镜:10×100×

2.6 微量移液器及配套枪头:量程为100 μL1000 μL

2.7 血球计数板。

2.8 注射器:量程为100 μL1000 μL

2.9 小鼠灌胃针头。

2.10 温湿度计。

2.11 接种环。

2.12 离心机离心力33000  g

2.13 无菌培养皿:直径90 mm

2.14 无菌量筒:容量100 mL

3 培养基和试剂

3.1 麦芽汁琼脂平板:商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,121℃高压灭菌15 min,制备麦芽汁琼脂平板,备用。

3.2 麦芽汁培养基:商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,121℃高压灭菌15 min,制备麦芽汁培养基,备用。

3.3 无菌生理盐水:商品化的生理盐水或8.5 g NaCl溶于1000 mL蒸馏水中,分装后121℃高压灭菌15 min,备用。

如拟评价菌株在麦芽汁培养基上的生长状态不理想,可选用适于该菌株生长的其他培养基。

4 实验动物

选用SPF级昆明或ICR健康小鼠,雌雄各半,体重范围为18.0 g22.0 g

5 操作步骤

    所有拟评价菌株必须使用腹腔注射和经口灌胃两种途径给予动物受试物以评价不同受试物暴露途径对动物的致病性

5.1 腹腔注射

5.1.1 菌悬液制备

将拟评价菌株接种麦芽汁琼脂平板,28℃±1℃培养一定时间(培养时间长短视不同种而异)后,刮取平板上的菌落,将其悬浮于无菌生理盐水中,充分混匀后用血球计数板计数,并用适量无菌生理盐水调整菌悬液浓度,使菌悬液中菌的最终浓度不低于5.0×107 CFU/mL

5.1.2 注射

小鼠不少于40只,雌雄各半,分别随机分成4组(每组不少于10只),包括雄性小鼠生理盐水对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠生理盐水对照组及雌性小鼠菌悬液组,每只小鼠注射0.2 mL,即受试物组每只小鼠注射的菌量不少于1.0×107 CFU

5.1.3 观察

动物腹腔注射后每天观察1次,至少连续观察21 d,观察指标同附录A中的5.1.4

5.2 经口灌胃

5.2.1 菌株培养

将菌株接种到麦芽汁培养基上,28℃±1℃培养一定时间(培养时间长短视不同种而异)后,备用。

5.2.2 菌数预估

无菌吸取上述5.2.1的培养液,分别加至两个无菌离心管中,每管1 mL3000  g 离心10 min,弃去上清液后,用适量无菌生理盐水调整菌悬液浓度并计数,使最终菌悬液中菌的浓度分别不低于2.5×108 CFU/mL6.25×108 CFU/mL,并分别记录每mL培养液离心后所得沉淀物中酵母菌数调整至2.5×108 CFU/mL6.25×108 CFU/mL时加入无菌生理盐水的体积(mL)。

5.2.3 菌悬液制备

5.2.3.1 培养上清液的制备

根据受试动物总数和每只动物的灌胃体积计算所需要的受试菌株培养液用量,继而将培养液一分为二,3000  g 各离心10 min后,将上清液分别转至100 mL无菌量筒中,一份上清液作为菌悬液原液的制备,另一份上清液冷冻浓缩至原体积的五分之二,作为2.5倍浓缩上清液,备用。

5.2.3.2 菌悬液原液的制备

按照5.2.2中获得的酵母终浓度达到2.5×108 CFU/mL所需要的生理盐水体积,根据离心的培养物体积,按相同比例加入5.2.3.1获得的上清液,调整离心后的沉淀物使其酵母数达到2.5×108 CFU/mL(上清液量不够时可用空白培养基补齐)。

5.2.3.3 浓缩菌悬液的制备

按照5.2.2中获得的酵母菌终浓度达到6.25×108 CFU/mL所需要的生理盐水体积,根据离心的培养物体积,按相同比例加入5.2.3.1获得的培养上清液2.5倍浓缩液,调整离心后的沉淀物使其菌数达到6.25×108 CFU/mL

5.2.4 灌胃

小鼠不少于80只,雌雄各半,分别随机分成8组(每组不少于10只),包括雄性小鼠培养基对照组、雄性小鼠菌悬液组、雄性小鼠2.5倍浓缩培养基对照组、雄性小鼠2.5倍菌悬液组;雌性小鼠培养基对照组、雌性小鼠菌悬液组、雌性小鼠2.5倍浓缩培养基对照组及雌性小鼠2.5倍菌悬液组。各组均以20 mL/kg·BW的体积给小鼠灌胃1次,灌胃前应禁食过夜(16 h),灌胃后3 h4 h喂食。

5.2.5 观察

动物经口灌胃后每天观察1次,至少连续观察21 d,观察指标同附录A中的5.1.4

6 结果与报告

5.15.2的动物验结果进行统计学分析和综合评价,内容同附录A中的条款6



 

保健食品理化及卫生指标检验与评价技术指导原则2020年版

 

 

 

 

 

 

 

 


第一部分 总则 3

一、主题内容和适用范围 4

二、基本要求 5

第二部分 功效成分/标志性成分检验方法 7

一、保健食品中红景天苷和酪醇的测定 8

二、保健食品中大蒜素的测定 12

三、保健食品中芦荟苷的测定 15

四、保健食品中左旋肉碱的测定 18

五、保健食品中α-亚麻酸、γ-亚麻酸的测定 22

六、保健食品中人参皂苷的测定 26

七、保健食品中花青素的测定 31

八、保健食品中核苷酸的测定 33

九、保健食品中洛伐他汀的测定 39

十、保健食品中槲皮素、山柰素、异鼠李素的测定 43

十一、保健食品中茶氨酸的测定 47

十二、保健食品中五味子醇甲、五味子甲素和乙素的测定 51

十三、保健食品中腺苷的测定 55

十四、保健食品中总皂苷的测定 59

十五、保健食品中总黄酮的测定 64

十六、保健食品中壳聚糖脱乙酰度的测定 69

十七、保健食品中总蒽醌的测定 71

十八、保健食品中10-羟基-2-癸烯酸的测定 73

十九、保健食品中绞股蓝皂苷XL IX的测定 77

二十、保健食品中总三萜的测定 81

二十一、保健食品中虫草素的 83

二十二、保健食品中D-甘露醇的测定 86

二十三、保健食品中功效成分/标志性成分食品安全国家标准检测方法 89

第三部分 溶剂残留的测定 90

第四部分 违禁成分的测定 95

 

 

 

 

 


 

第一部分 总则

 

 


一、主题内容和适用范围

 

 

1.本指导原则规定了保健食品及其原料、辅料理化及卫生指标检验与评价的基本要求、功效成分/标志性成分检验方法、溶剂残留和违禁成分的测定要求

2.本指导原则适用于保健食品的注册和备案检验。

二、基本要求

 

1. 保健食品应符合《食品安全国家标准 保健食品》GB 16740的各项要求和检验方法规定。对于不同配方、不同形态、不同工艺的产品,申请人应同时制定符合要求的理化、功效成分/标志性成分、微生物等指标对产品质量进行有效控制。

2. 直接接触保健食品的包装材料应符合相应食品安全国家标准及相关规定。

3. 普通食品形态产品应检测并制定净含量及允许负偏差指标,指标应符合《定量包装商品净含量计量检验规则》(JJF 1070)规定。胶囊等非普通食品形态产品应制定装量或重量差异指标。装量或净含量只检测内容物,不包括隔离材料。

4. 最小服用单元含有惰性隔离材料填充的产品,如胶囊,其功效成分或者指标成分、农药残留、灰分、水分等指标以去除隔离材料(胶囊壳)的内容物为检测单元,对于非法添加药物、重金属、铬、色素(如材料带颜色)等则需要进行整体检测,或者检测结果明确标识相关检测部位。

5. 本指导原则第二部分提供的检测方法为推荐方法注册申请人在对产品进行功效成分/标志性成分检测时,应选择适合相应产品的检测方法。申请注册检验时,应提供该产品的配方、工艺、产品技术要求及功效成分/标志性成分检测方法以及检测方法的适用性、重现性等方法学研究材料。检测方法应科学、适用、重现。注册检验机构对所附材料进行审核,必要时进行有关验证和方法确认,如申报单位提供的方法不适合送检的样品时,注册检验机构不得擅自修改,应将有关情况反馈申报单位,由其进行研究并提供方法后,再对送检样品进行试验,确保试验方法与送检产品技术要求中规定的方法一致。复核检验机构应按照申报单位提交的检验方法进行检验并出具复核检验报告。

6. 注册申请人应当自行开展或委托具备法定资质的注册检验机构按照国家相关规定和标准等要求,根据样品具体情况,合理地进行稳定性试验设计和研究。通过稳定性试验,考察样品在不同环境条件下(如温度、相对湿度等)的化学、物理及生物学特征随时间增加其变化程度和规律,从而判断样品包装、贮存条件和保质期内的稳定性。产品稳定性重点考察指标,主要包括感官、微生物、崩解时限(溶散时限、溶化性等)、水分、pH值、酸价、过氧化值、列入理化指标中的特征成分等随储存条件和储存时间容易发生变化的指标。产品非稳定性重点考察指标,主要包括鉴别、灰分、污染物(如铅、总砷、总汞等)、真菌毒素、农残(如六六六、滴滴涕等)、国家相关标准及现行规定有用量限制的合成色素和甜味剂等随储存条件和存时间不易发生变化的指标,以及国家相关标准及现行规定有用量限制的抗氧化剂指标。

稳定性试验为注册申请人自行开展的,组织实施的检验质量控制、报告编制、样品和档案管理等工作以及出具的报告格式内容,应当符合有关规定。稳定性试验为注册申请人委托检验的,被委托单位应当为具有法定资质的食品检验机构。

7. 标准规定不得检出的项目结果,检测结果在方法定量限以上时,按照具体检出值报送结果;检测结果在方法检出限以下时,注明未检出,检出限值;检测结果在方法检出限以上、定量限以下时,注明检出且小于定量限,定量限值,检出限值

8. 保健食品中原料和辅料应符合保健食品原辅料质量要求的有关规定,有适用的国家相关标准、地方标准、行业标准等的,其质量应符合相关规定。原辅料质量要求内容有缺项难以或无需制定的,应说明原因。原料若为植物提取物或者原料及辅料加工过程中使用、间接引入有机溶剂时,涉及的有机溶剂应符合《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》GB 2760附录C中食品工业用加工助剂使用名单规定,或有关规定。企业可根据产品质量控制需要,采用本指导原则中第三部分溶剂残留的测定方法将溶剂残留检测列入原料或产品的技术要求。

9. 违禁成分的检测作为相应保健功能类别产品的功能试验样品注册检验要求,应当符合本指导原则第四部分的规定。

 

 

第二部分

功效成分/标志性成分检验方法

 

 


一、保健食品中红景天苷和酪醇的测定

                                                                               

 

范围

本方法规定了以红景天为主要原料的保健食品中红景天苷和酪醇的液相色谱测定方法。

本方法适用于保健食品中红景天苷和酪醇的测定。

 

原理

试样经甲醇超声提取,以0.01mol/L乙酸铵-甲醇为流动相(80+20),采用高效液相色谱法,紫外检测器检测,根据保留时间定性,外标法定量。

 

试剂和材料

注:除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。

3.1 试剂

3.1.1 乙酸铵(CH3COONH4

3.1.2 甲醇(CH3OH):色谱纯。

3.1.3 甲醇(CH3OH)。 

3.2 标准品

红景天苷、酪醇标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1,纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

1 红景天苷、酪醇标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

红景天苷

Salidroside

10338-51-9

C14H20O7

300.30

酪醇

Tyrosol

501-94-0

C8H10O2

138.16

3.3 标准溶液配制

3.3.1 红景天苷标准储备液(2.0mg/mL):准确称取红景天苷标准品20mg(精确至0.01mg10mL容量瓶中,用甲醇(3.1.2)溶解并定容至刻度,摇匀。

3.3.2 红景天苷标准工作液:将红景天苷标准储备液(3.3.1)用甲醇(3.1.2)稀释制备一系列标准溶液,标准系列浓度为0.00mg/mL0.01mg/mL0.02mg/mL0.05mg/mL0.20mg/mL0.50mg/mL,临用时配制。

3.3.3 酪醇标准储备液(2.0mg/mL):准确称取酪醇标准品20mg(精确至0.01mg10mL容量瓶中,用甲醇(3.1.2)溶解并定容至刻度,摇匀。

3.3.4 酪醇标准工作液:将酪醇标准储备液(3.3.3)用甲醇(3.1.2)稀释制备一系列标准溶液,标准系列浓度为0.00mg/mL0.01mg/mL0.02mg/mL0.05mg/mL0.10mg/mL0.20mg/mL,临用时配制。

3.3.5 系统适用性溶液:量取红景天苷标准储备液(3.3.1)和酪醇标准储备液(3.3.3)各0.5mL10mL容量瓶中,用甲醇(3.1.2)稀释至刻度,摇匀

3.4 试剂配制

乙酸铵溶液(0.01mol/L):称取0.77g乙酸铵,加入适量水溶解并定容至1000mL,经0.45μm滤膜(3.5.1)过滤后备用。

3.5 材料

3.5.1 水相微孔滤膜0.45μm

3.5.2 有机相微孔滤膜:0.45μm

 

仪器和设备

4.1 高效液相色谱仪:配有紫外检测器(UV)。

4.2 超声波清洗器。

4.3 分析天平:感量为0.01mg0.0001g

 

分析步骤

5.1 试样制备

5.1.1 固体样品:准确称取已粉碎混合均匀的固体待测试样适量(约含红景天苷5mg 25mL容量瓶中,加入甲醇3.1.3)约20mL超声提取30min,放冷至室温,用甲醇3.1.3定容至刻度。混匀后经0.45μm滤膜(3.5.2)过滤,供液相色谱分析用。

5.1.2 液体样品:准确吸取摇匀后的待测试样适量(约含红景天苷5mg),置于蒸发皿内,水浴蒸干,用甲醇溶解并3.1.3转移至25mL容量瓶中并定容至刻度。混匀后经0.45μm滤膜(3.5.2)过滤,供液相色谱分析用。

5.2 仪器参考条件

5.2.1 色谱柱:C18柱, 250mm×4.6mm5μm,或同等性能色谱柱;

5.2.2 流动相:乙酸铵溶液(0.01mol/L-甲醇(80+20);

5.2.3 流速:1.0mL/min

5.2.4 柱温:25℃

5.2.5 检测波长:215nm

5.2.6 进样量:10mL

5.2.7 系统适用性试验:取系统适用性溶液(3.3.510mL,注入液相色谱仪,记录色谱图,红景天苷峰与酪醇峰的分离度应大于1.5

5.3 标准曲线的制作  

将红景天苷标准系列工作液(3.3.2)或酪醇标准系列工作液(3.3.4)分别注入高效液相色谱仪中,测定相应的色谱峰高或峰面积,以标准工作液的浓度为横坐标,以峰面积或峰高为纵坐标,绘制标准曲线(标准溶液液相色谱图见附录A中图A.1

5.4 试样溶液的测定

将试样待测液(5.1.15.1.2)注入液相色谱仪中,以保留时间定性,测得峰面积或峰高,根据标准曲线得到待测液红景天苷酪醇的浓度(样品溶液液相色谱图见附录A中图A.2)。

 

结果计算

试样中红景天苷酪醇含量按下式计算:

式中:

X试样中红景天苷酪醇的含量,单位为毫克每克或毫克每毫升(mg/gmg/mL);  

C由标准曲线查得待测样液中红景天苷酪醇的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL);

V样品的定容体积,单位为毫升(mL);

m样品量,单位为克或毫升(gmL)。

计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,保留两位有效数字。

 

精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%

 


附录 A

标准溶液和试样溶液典型液相色谱图

 

 

A.1 红景天苷和酪醇标准溶液(0.1mg/mL)色谱图

 

 

A.2 含有红景天苷和酪醇的试样溶液色谱图

 


二、保健食品中大蒜素的测定

                                                                              

 

1   范围

本方法规定了保健食品中大蒜素(二烯丙基三硫化物)的测定方法。

本方法适用于以大蒜及其加工品为主要原料制成的保健食品中大蒜素(二烯丙基三硫化物)的测定。

 

2   原理

试样经有机溶剂提取,通过气相色谱检测,以保留时间定性,外标法定量。

 

3   试剂和材料

   除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯。

3.1 试剂

3.1.1 无水乙醇(C2H5OH)。

3.1.2 正己烷(CH3(CH2)4CH3)。

3.1.3 无水硫酸钠(Na2SO4)。

3.2 标准品

大蒜素标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1,纯度≥99.0%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

1 大蒜素标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

大蒜素

Allitride

2050-87-5

C6H10S3

178.33

3.3 标准溶液配制

3.3.1 大蒜素标准储备液(5.0mg/mL):称取125.0mg大蒜素于25mL容量瓶中,用正己烷(3.1.2)定容至刻度,摇匀。此溶液可在4冰箱中保存七天。

3.3.2 大蒜素标准工作液:分别准确吸取不同体积的标准储备液(3.3.1),用正己烷(3.1.2)将其稀释成大蒜素含量分别为0.1mg/mL0.5mg/mL1.0mg/mL1.5mg/mL2.0mg/mL的标准系列工作溶液,临用配制。

3.4 材料

微孔滤膜:0.45μm,有机相。

 

4   仪器和设备

4.1 气相色谱仪:配有氢火焰离子化检测器(FID)。

4.2 分析天平:感量为0.01mg0.0001g

4.3 超声清洗器。

 

5   分析步骤

5.1 试样制备

5.1.1 固体试样

称取已粉碎混合均匀的固体待测试样适量(含待测组分约5mg,精确到0.0001g)于5mL容量瓶中,加无水乙醇2.5mL,密塞,超声(功率800W,频率40kHz)提取20min,取出冷却至室温,加正己烷定容,摇匀,过0.45μm微孔滤膜过滤,待上机测试用。

5.1.2 油状试样

称取已混合均匀的油状待测试样适量(含待测组分约5mg,精确到0.0001g)于5mL容量瓶中,加正己烷溶解并定容,摇匀,过0.45μm微孔滤膜过滤,待上机测试用。

5.1.3 含水液体试样

精密吸取已混合均匀的待测试样适量(含待测组分约10mg),置于分液漏斗中,加4mL正己烷振摇提取1min,静置分层,取上层清液过无水硫酸钠,提取两次。用适量正己烷冲洗无水硫酸钠,合并至同一10mL容量瓶中,用正己烷定容至刻度,摇匀。过0.45μm微孔滤膜过滤,待上机测试用。

5.2 仪器参考条件

5.2.1 色谱柱:(5%-苯基)-甲基聚硅氧烷固定相,柱长30m,内径0.25mm,膜厚0.25μm或其他同等性能色谱柱。

5.2.2 柱温箱温度:起始温度100℃保持3min10℃/min速度升至150℃,再以20℃/min速度升至200℃,保持20min

5.2.3 进样口温度:220℃

5.2.4 检测器温度:250℃

5.2.5 载气:高纯氮气,流量1.0mL/min

5.2.6 氢气:40mL/min;空气:400mL/min

5.2.7 进样量:1μL

5.3 测定

1μL的标准工作溶液(3.3.2)和试样溶液(5.1)注入气相色谱仪中,以保留时间定性,测得峰面积或峰高,外标法定量。

标准工作溶液图谱及试样溶液图谱见附录A

 

6   结果计算

试样中大蒜素含量按下式计算:

式中:

W大蒜素的含量,单位为克每百克或克每百毫升(g/100gg/100mL);

A1试样溶液色谱峰面积或峰高;

A2标准工作液峰面积或峰高;

C标准工作液浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL);

V试样定容体积,单位为毫升(mL);

m试样的质量或体积,单位为克或毫升(gmL);

100—单位转换;

1000—单位转换。

计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,保留三位有效数字。

 

7   精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%

 

 

附录A

标准溶液和试样溶液典型气相色谱图

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

A.1大蒜素标准溶液色谱图

 

 

A.2含有大蒜素的试样溶液色谱图

 


三、保健食品中芦荟苷的测定

 

范围

方法规定了保健食品中芦荟苷含量的高效液相色谱测定方法。

方法适用于以芦荟及其加工品为主要原料的保健食品中芦荟苷含量的测定。

 

原理

样品用甲醇+水(55+45)作为溶剂,提取试样中的芦荟苷,经C18柱分离,在293nm波长处检测,以芦荟苷保留时间定性,峰面积外标法定量。

 

试剂和材料

除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。

3.1 试剂

3.1.1 甲醇(CH3OH):色谱纯。

3.1.2 石油醚:沸程30℃60℃

3.2 标准品

芦荟苷标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1纯度≥90%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

1 芦荟苷标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

芦荟苷

Aloin

1415-73-2

C21H22O9

418.39

3.3 标准溶液配制

3.3.1 芦荟苷标准储备液:称取芦荟苷标准样品(3.210mg(精确至0.01mg)于25mL容量瓶中,加流动相溶解并定容至刻度,摇匀,此溶液浓度为0.4mg/mL。临用新配。

3.3.2 芦荟苷标准系列工作液:分别准确吸取芦荟苷标准储备液(3.3.10.5mL1.0mL2.0mL4.0mL6.0mL10mL容量瓶中,用流动相定容,得浓度为0.02mg/mL0.04mg/mL0.08mg/mL0.16mg/mL0.24mg/mL的标准系列工作液。

3.4 微孔滤膜:0.45μm,有机相。

 

仪器和设备

4.1 高效液相色谱仪:配有二极管阵列检测器或紫外检测器。

4.2 超声波清洗器。

4.3 分析天平:感量分别为0.01mg0.001g

4.4 离心机:转速≥3000r/min

 

分析步骤

5.1 试样制备

5.1.1 固体试样

称取已粉碎混合均匀的待测试样适量(约含芦荟苷4mg,精确到0.001g),置具塞锥形瓶中,加入50.0mL流动相(5.2.2),称重,超声处理20min,放冷,用流动相补足减失的重量,摇匀,经微孔滤膜(3.4)过滤,滤液待测。必要时可进行适当稀释。

5.1.2 含油基质试样

称取已粉碎混合均匀的待测试样适量(约含芦荟苷4mg,精确到0.001g),置具塞锥形瓶中,加入25.0mL石油醚(3.1.2),涡旋使充分混匀,过滤,弃去石油醚液,再用少量石油醚洗涤锥形瓶及滤纸,挥干,将滤纸和残渣置于原具塞锥形瓶中,加入50.0mL流动相(5.2.2),称重,超声处理20min,放冷,用流动相补足减失的重量,摇匀,经微孔滤膜(3.4)过滤,滤液待测。必要时可进行适当稀释。

5.1.3 水性液体试样

吸取待测试样,必要时以流动相(5.2.2)适当稀释,离心,取上清液经微孔滤膜(3.4)过滤。

5.2 仪器参考条件

5.2.1 色谱柱:C18柱, 250mm×4.6mm5μm,或性能相当者。

5.2.2 流动相:甲醇(3.1.1+水,(55+45v/v)。  

5.2.3 流速:1.0mL/min

5.2.4 柱温:40℃

5.2.5 检测波长:293nm

5.2.6 进样量:10μL

5.3 标准曲线的制作

将标准系列工作液(3.3.2)分别按液相色谱参考条件(5.2)进行测定,得到相应的芦荟苷标准溶液的色谱峰面积,以标准工作液的浓度为横坐标,以色谱峰的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。

5.4 试样溶液的测定

将试样溶液(5.1)按液相色谱参考条件(5.2)进行测定,得到相应的样品溶液芦荟苷的色谱峰面积,根据标准曲线得到待测液中芦荟苷的浓度,平行测定次数不少于两次。

芦荟苷的标准液相色谱图参见附录A的图A.1

 

结果计算

试样中芦荟苷含量按下式计算:

    式中:

X试样中芦荟苷的含量,单位为克每百克(g/100g)或克每百毫升(g/100mL);

C由标准曲线得出的样液中芦荟苷的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL);

V试样的最终定容体积,单位为毫升(mL);

m试样取样量,单位为克(g)或毫升(mL);

100—单位转换;

1000—单位转换。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,保留三位有效数字。

 

精密度

在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%


附录A

 

芦荟苷的高效液相色谱图

 

 

 

A.1 芦荟苷标准溶液色谱图

 

 

 


四、保健食品中左旋肉碱的测定

 

1   范围

本方法规定了保健食品中左旋肉碱的液相色谱测定方法。

本方法适用于以左旋肉碱为主要原料的保健食品中肉碱的含量测定。

 

2   原理

试样中的左旋肉碱以0.50mmol/L的盐酸溶液经超声提取,反相色谱分离,以保留时间定性,外标法定量。

 

3   试剂和材料

除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。

3.1 试剂

3.1.1 磷酸氢二钾(K2HPO4)。

3.1.2 辛烷磺酸钠(C8H17NaO3S)。

3.1.3 盐酸(HCl):含量:36%~38%

3.1.4 磷酸(H3PO4)。

3.1.5 硅藻土(SiO2):粒径范围:0.2-0.8mm

3.1.6 乙腈(CH3CN):色谱纯。

3.2 标准品

左旋肉碱标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1,纯度≥98%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质

1 左旋肉碱标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

左旋肉碱

L-Carnitine

541-15-1

C7H15NO3

161.20

3.3 标准溶液配制

3.3.1 左旋肉碱标准储备液:称取25mg(准确至0.01mg)左旋肉碱标准品(3.2)于25mL容量瓶中,用盐酸溶液(3.4)溶解并定容至刻度,摇匀。此溶液浓度为1.0mg/mL

3.3.2 左旋肉碱标准系列工作液:分别准确吸取左旋肉碱标准储备液(3.3.10.50mL1.0mL2.0mL3.0mL4.0mL5.0mL5mL容量瓶中,用盐酸溶液(3.4)稀释至刻度,得浓度分别为0.10mg/mL0.20mg/mL0.40mg/mL0.60mg/mL0.80mg/mL1.00mg/mL的标准系列工作液。临用时配制。

3.4 盐酸溶液(0.5mmol/L):准确吸取4.2mL盐酸(3.1.3),用水定容至100mL。摇匀后,再吸取上述溶液1.0mL,用水定容至1L

3.5 缓冲盐溶液:分别准确称取3.4g磷酸氢二钾(3.1.1)和0.4325g辛烷磺酸钠(3.1.2),用水溶解并定容至1L,摇匀,用磷酸(3.1.4)调至pH=2.5,经微孔滤膜(3.6)过滤,待用。

3.6 微孔滤膜:0.45μm,水相。

 

4   仪器和设备

4.1 高效液相色谱仪:配有紫外(UV)检测器或二极管阵列(DAD)检测器

4.2 分析天平:感量分别为0.01mg0.0001g0.001g

4.3 超声波提取器:功率250W,频率33kHz

 

5   分析步骤

5.1 试样制备

5.1.1 试样提取

5.1.1.1 固体试样

准确称取粉碎并混合均匀的试样0.1g~2g(准确至0.0001g,含待测组分约5mg~50mg),于50mL容量瓶中,加入盐酸溶液(3.4)约35mL,超声提取10min,放至室温,用盐酸溶液(3.4)稀释至刻度,摇匀,过滤,弃初滤液,收集续滤液,再经微孔滤膜(3.6)过滤,续滤液进液相色谱仪分析。

5.1.1.2 软胶囊试样

取软胶囊剪开,挤出内容物并混匀,准确称取2g(准确至0.0001g),准确加入等量硅藻土(3.1.5),研至分散均匀,准确称取其中部分(准确至0.0001g,含待测组分约5mg~50mg),转移至250mL具塞三角瓶中,吸取盐酸溶液(3.450.0mL,并入三角瓶中,称重(准确至0.001g),加塞超声提取10min,放至室温,用盐酸溶液(3.4)补足重量,摇匀,过滤,弃初滤液,收集续滤液,再经微孔滤膜(3.6)过滤,续滤液进液相色谱仪分析。

5.1.1.3 液体试样

准确吸取混匀后的试样1.0mL~5.0mL(含待测组分约5mg~50mg),于50mL容量瓶中,加入盐酸溶液(3.4)约35mL,超声提取10min,放至室温,用盐酸溶液(3.4)稀释至刻度,摇匀,过滤,弃初滤液,收集续滤液,再经微孔滤膜(3.6)过滤,续滤液进液相色谱仪分析。

5.1.2 试样溶液稀释

必要时,根据试样溶液中左旋肉碱含量,用盐酸溶液(3.4)进行适当的稀释(稀释倍数F),使待测溶液中左旋肉碱的浓度在0.10mg/mL~1.00mg/mL范围内。

5.2 仪器参考条件

5.2.1 色谱柱:C18柱: 250mm×4.6mm5μm或同等性能的色谱柱。

5.2.2 流动相:缓冲盐溶液(3.5+3.1.6),(90+10v/v)。

5.2.3 流速:0.8mL/min

5.2.4 检测波长:210nm

5.2.5 进样量:20μL

5.3 标准曲线的制作

将左旋肉碱标准系列工作液(3.3.2)分别按液相色谱参考条件(5.2)进行测定,得到相应的左旋肉碱标准溶液的色谱峰面积。以标准工作液的浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。

5.4 待测溶液的测定

将待测溶液(5.1)按液相色谱参考条件(5.2)进行测定,得到相应的待测溶液左旋肉碱的色谱峰面积,根据标准曲线得到待测溶液中左旋肉碱的浓度,平行测定次数不少于两次。

左旋肉碱的标准液相色谱图参见附录A的图A.1

 

6   结果计算

试样中左旋肉碱含量按下式计算:

 

式中:

X试样中左旋肉碱的含量,固体和软胶囊试样的单位为克每百克(g/100g),液体试样的单位为克每百毫升(g/100mL);

C根据标准曲线计算待测溶液中左旋肉碱的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL);

V试样提取时的定容体积,单位为毫升(mL);

m试样称取的质量,单位为克(g);或液体试样吸取的体积,单位为毫升(mL);

F稀释倍数;

100—单位转换;

1000—单位转换。

计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字。

 

7   精密度

在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


附录 A

左旋肉碱的高效液相色谱图

 

A.1 左旋肉碱的高效液相色谱图

 


 五、保健食品中α-亚麻酸、γ-亚麻酸的测定

 

范围

本方法规定了保健食品中α-γ-亚麻酸的测定方法。

本方法适用于油脂类保健食品中α-γ-亚麻酸含量的测定。

 

原理

将油脂试样(或试样提取的脂肪),经氢氧化钾皂化,在三氟化硼存在下甲醇酯化,然后用气相色谱仪分析,采用外标法定量。

 

试剂和材料

除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。

3.1 试剂

3.1.1 正己烷(C6H14

3.1.2 氢氧化钾(KOH

3.1.3 三氟化硼甲醇溶液:浓度为15%

3.1.4 甲醇(CH3OH):色谱纯。

3.1.5 氯化钠(NaCl

3.2 标准品

α-γ-亚麻酸甲酯标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1,纯度≥99.0%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质

1 α-γ-亚麻酸甲酯标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

α-亚麻酸甲酯

Methy α- linolenate

301-00-8

C19H32O2

292.46

γ-亚麻酸甲酯

Methy γ- linolenate

16326-32-2

C19H32O2

292.46

3.3 标准溶液配制

3.3.1标准储备液:称取α-亚麻酸甲酯、γ-亚麻酸甲酯标准品(3.2)各25.0mg(精确至0.01mg),分别置25mL容量瓶中,用正己烷(3.1.1)溶解并定容至刻度,溶液浓度为1.0mg/mL。贮存于-18℃冰箱中。

3.3.2 标准工作液:吸取α-亚麻酸甲酯和γ-亚麻酸甲酯标准储备液,稀释成含量分别为0.10mg/mL0.20mg/mL0.40mg/mL0.50mg/mL的混合标准系列工作液。临用时配制。

3.4氢氧化钾甲醇溶液(0.5mol/L):称取氢氧化钾(3.1.22.8g,用甲醇(3.1.4)溶解并定容至100mL,混匀。

3.5 饱和氯化钠溶液:称取氯化钠(3.1.5360g,溶解于1.0L水中,搅拌溶解,澄清备用。

 

仪器和设备

4.1 气相色谱仪:配有氢火焰(FID)检测器。

4.2 分析天平:感量分别为0.0001g0.001g

4.3 加热式磁力搅拌器。

4.4 标准磨口烧瓶(50mL)和直形冷凝管。

 

分析步骤

5.1 试样制备

5.1.1 脂肪的提取 按GB 5009.6中规定的方法提取。

5.1.2 皂化

称取0.100g油脂(或脂肪)和磁力搅拌子一并放入50mL磨口烧瓶中(见图1)加入4mL 0.5mol/L氢氧化钾甲醇溶液,上部连接回流冷凝管,并固定于磁力搅拌器上,由冷凝管上口向溶液中导入氮气,使反应瓶中始终充满氮气。开启磁力搅拌器,并加热使反应液保持65±5℃,搅拌回流约15min(至无油滴为止)。

5.1.3 酯化

从冷凝管上部加入4mL三氟化硼甲醇溶液,搅拌(65±5℃),回流约2min,冷至室温, 从冷凝管上部加入5mL正己烷继续搅拌5min,移去冷凝管,加入5mL饱和氯化钠水溶液, 摇动数分钟,转移至25mL分液漏斗中分离水与有机相,再加3mL正己烷洗水相,分离,弃水相,合并有机相并用正己烷定容至10.0mL(浓度低时吹氮浓缩至1.0mL),供测定用。

5.2 仪器参考条件

5.2.1 色谱柱:FFAP(改性聚乙二醇20M30m×0.25mm i.d.0.25μm

5.2.2 柱箱温度:215℃

5.2.3 进样口温度:250℃

5.2.4 检测器温度:260℃

5.2.5 氮气:1.5mL/min,载气:50mL/min

5.3定性分析

在上述仪器条件下,分别取标准储备液和试样测定液1.0μL,注入气相色谱仪,以保留时间来确定α-γ-亚麻酸甲酯。

5.4 定量分析

试样中α-亚麻酸甲酯或γ-亚麻酸甲酯色谱峰面积或峰高与标准的比较定量。

标准样品溶液和试样溶液液相色谱图参见附录A的图A.1和图A.2

 

结果计算

α-亚麻酸甲酯或γ-亚麻酸含量(以脂肪计)按下式计算:

式中:

X—α-亚麻酸或γ-亚麻酸含量(以脂肪计),g/100g

A1试样待测液中α-亚麻酸甲酯或γ-亚麻酸甲酯色谱峰面积或峰高;

A2标准使用液色谱峰面积或峰高;

ρ标准使用液浓度,mg/mL

v正己烷定容体积,mL

m试样质量,g

0.952—亚麻酸换算系数。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字。

 

精密度

在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%

 

 

1 皂化酯化装置图

 

 

 

 


附录A

标准溶液和试样溶液典型液相色谱图

A.1 α-亚麻酸甲酯、γ-亚麻酸甲酯标准溶液色谱图

 

 

 

A.2 试样溶液色谱图

 

 


六、保健食品中人参皂苷的测定

                                                                                 

 

1   范围

本方法规定了保健食品中人参皂苷的高效液相色谱测定方法。

本方法适用于以人参及其加工品为主要原料的保健食品中人参皂苷ReRg1Rb1RcRb2Rd含量的测定。

 

2   原理

将试样中的人参皂苷溶解、提取,经净化处理后,使用梯度洗脱反相高效液相色谱进行分离,紫外检测器检测(或蒸发光散射检测器,根据色谱峰的保留时间定性,外标法定量。

 

3   试剂和材料

注:水为GB/T 6682规定的一级水。

3.1 试剂

3.1.1 乙腈(CH3CN):色谱纯。

3.1.2 甲醇(CH3OH):色谱纯。

3.1.3 D101大孔吸附树脂(粒径:I.D φ15*L150mm)。

3.2  标准品

人参皂苷ReRg1Rb1RcRb2Rd标准品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1,纯度≥98%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质

1 人参皂苷标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

人参皂苷Re

Ginsenoside Re

52286-59-6

C48H82O18

947.15

人参皂苷Rg1

Ginsenoside Rg1

22427-39-0

C42H72O14

801.01

人参皂苷Rb1

Ginsenoside Rb1

41753-43-9

C54H92O23

1109.29

人参皂苷Rc

Ginsenoside Rc

11021-14-0

C53H90O22

1079.27

人参皂苷Rb2

Ginsenoside Rb2

11021-13-9

C53H90O22

1079.27

人参皂苷Rd

Ginsenoside Rd

52705-93-8

C48H82O18

947.15

3.3 标准溶液配制

3.3.1 人参皂苷ReRg1Rb1RcRb2Rd标准储备液:分别称取人参皂苷ReRg1Rb1RcRb2Rd标准样品(3.2100mg610mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,溶液浓度为10mg/mL

3.3.2 人参皂苷ReRg1Rb1RcRb2Rd混合标准系列工作液:分别精密吸取不同体积的标准储备液(3.3.1)于同一10mL容量瓶中,用甲醇将其稀释成人参皂苷ReRg1Rb1RcRb2Rd含量分别为0.10mg/mL0.20mg/mL0.40mg/mL0.80mg/mL1.00mg/mL的混合标准系列工作液。

 

4   仪器和设备

4.1 高效液相色谱仪:配有紫外检测器或蒸发光散射检测器。

4.2 超声波清洗器。

4.3 离心机。

4.4 水浴锅。

4.5 分析天平:感量分别为0.1mg0.001g

 

5   分析步骤

5.1 试样制备

5.1.1 固体试样

取试样研成粉末,并过20目筛。称取该粉末样适量(相当于含总人参皂苷约75mg,精确至0.001g),于50mL容量瓶中,加水45mL于超声波清洗器中超声提取30分钟,取出,待放至室温后,加水定容至刻度,摇匀,滤过,准确吸取续滤液10mL,通过D101大孔吸附树脂净化柱(3.1.3)(大孔吸附树脂使用前先经甲醇浸泡,水洗,装成10cm长,直径1~1.5cm的小柱),小柱先用10mL水冲洗,弃去水液之后,用70%甲醇25mL洗脱皂苷,收集甲醇溶液,水浴上蒸干,残渣以甲醇(3.1.2)溶解并定容至5.0mL,该样液离心后过0.45μm尼龙滤膜,滤液进液相色谱仪分析。

5.1.2 液体试样

取一定量的试样(相当于含总人参皂苷约75mg),旋转蒸发至干,残渣以50mL水超声提取30分钟,余下步骤与5.1.1相同。

5.1.3 软胶囊试样

称取混合均匀的待测试样内容物适量(相当于含总人参皂苷约75mg,精确至0.001g),余下步骤与5.1.1相同。

5.2 色谱参考条件

5.2.1色谱柱:C18柱,250mm×4.6mm5μm,或同等性能的色谱柱。

5.2.2流动相:A相为乙腈(3.1.1),B相为水,梯度洗脱条件见表2

2梯度洗脱条件

时间(min

A/ %

B/ %

0

16

84

20

18

82

55

40

60

65

40

60

66

100

0

71

100

0

72

16

84

85

16

84

5.2.3 流速:1.0mL/min

5.2.4 柱温:35°C

5.2.5 进样量:5μL

5.2.6 紫外检测器条件:检测波长:203nm

5.2.7 蒸发光散射检测器条件:

    蒸发温度:105°C漂移管温度:60°C;气流速1.6L/min

5.3 标准曲线的制作

将混合标准系列工作液(3.3.2)分别按液相色谱参考条件(5.2)进行测定,得到相应的峰面积,以标准工作液的浓度(或浓度对数为横坐标,以峰面积(或峰面积对数为纵坐标,绘制标准曲线。

5.4 试样溶液的测定

将试样溶液(5.1)按液相色谱参考条件(5.2)进行测定,以保留时间定性,测得峰面积,根据标准曲线得到试样溶液中人参皂苷ReRg1Rb1RcRb2Rd的浓度。

标准溶液和试样溶液的高效液相色谱图参见附录A(紫外检测器)和附录B(蒸发光散射检测器

 

6   结果计算

试样中各人参皂苷的含量按下式计算:

 

式中:

Xi——试样中各人参皂苷的含量,单位为克每百克或克每百毫升(g/100gg/100mL)

Ci——由标准曲线查得测定样液中各人参皂苷的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL)

V——被测定样液的最终定容体积,单位为毫升(mL)

F——被测定样液的稀释倍数;

m——试样的取样量,单位为克或毫升(gmL)

100——单位转换;

1000——单位转换。

试样中总人参皂苷的含量按式(2)计算:

XXReXRg1XRb1XRcXRb2XRd………………2

式中:

X试样中总人参皂苷的含量,单位为克每百克或克每百毫升(g/100gg/100mL)

Xi试样中各人参皂苷(Xi包括人参皂苷ReRg1Rb1RcRb2Rd)的含量,单位为克每百克或克每百毫升(g/100gg/100mL)

计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,保留三位有效数字。 

 

7   精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%


附录A

 

标准溶液和试样溶液典型液相色谱图(紫外检测器

 

A.1 人参皂苷Rg1ReRb1RcRb2Rd的标准溶液色谱图

 

 

 

 

A.2 人参皂苷Rg1ReRb1RcRb2Rd的试样溶液色谱图


附录B

 

标准溶液和试样溶液典型液相色谱图(蒸发光散射检测器

 

 

B.1 人参皂苷Rg1ReRb1RcRb2Rd的标准溶液色谱图

 

 

 

 

B.2 人参皂苷Rg1ReRb1RcRb2Rd的试样溶液色谱图

 

 

 

 

 


七、保健食品中花青素的测定

                                                                            

 

1   范围

本方法规定了保健食品中花青素的测定方法。

本方法适用于保健食品中花青素的含量测定。

 

2   原理

花青素是含有儿茶素和表儿茶素单元的聚合物。花青素本身无色,但经过热酸处理后,可以生成深红色的花青素离子。本法用分光光度法测定花青素在水解过程中生成的花青素离子。计算试样中花青素含量。

 

3   试剂和材料

注:除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。

3.1 试剂

3.1.1 甲醇(CH3OH)。

3.1.2 正丁醇(CH3(CH2)3OH)。

3.1.3 盐酸(HCl)。

3.1.4 硫酸铁铵(NH4Fe(SO4)2·12H2O

3.2 试剂配制

3.2.1 盐酸(2mol/L):取盐酸90mL,加水适量使成500mL,摇匀。

3.2.2 硫酸铁铵溶液:称取10g硫酸铁铵,用2mol/L盐酸溶解并定容至500mL,混匀,此溶液中硫酸铁铵浓度为2%w/v

3.3 标准品

花青素(葡萄籽来源)标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1,纯度≥95%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质

1 花青素(葡萄籽来源)标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

花青素(葡萄籽来源)

Proanthocyanidins

4852-22-6 

C30H26O13 

594.52

说明:因为花青素本身是一类物质(一般指2~4分子的聚合物),所以此标准样品为推荐使用

3.4 标准品溶液的配制

花青素标准储备液(1.0mg/mL):称取10mg(精确至0.1mg花青素标准品10mL 容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀。

 

4   仪器和设备

4.1 分析天平:感量为0.1mg0.001g

4.2 分光光度计。

4.3 离心机:转速≥4000r/min

4.4 超声仪。

4.5 回流装置。

 

5   分析步骤

5.1 试样制备

5.1.1 固体试样:称取已粉碎混合均匀的待测试样50mg~100mg(精确至0.1mg),置于50mL容量瓶中,加入30mL甲醇,超声处理20min,放冷至室温后,加甲醇至刻度,摇匀,离心或放置至澄清后取上清液备用。

5.1.2 含油试样:称取混合均匀的待测试样50mg(精确至0.1mg),置于小烧杯中,用2030mL甲醇分数次搅拌,将提取液转移至50mL容量瓶中,直至甲醇提取液无色,加甲醇至刻度,摇匀。

5.1.3 液体试样:吸取不超过1mL的待测试样,置于50mL容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。

5.2 试样测定

将正丁醇与盐酸按95:5的体积比混合后,取出6.0mL置于具塞锥形瓶中,再加入0.2mL硫酸铁铵溶液和1.0mL试样溶液,混匀,置沸水浴回流,精确加热40min后,立即置冰水中冷却,在加热完毕15min后,于546nm波长处测吸光度,由标准曲线计算试样中花青素的含量。显色在1小时内稳定。

5.3 标准曲线制备

分别吸取花青素标准储备液0.00mL0.10mL0.25mL0.50mL1.00mL1.50mL置于10mL容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。各吸取1.0mL测定,与试样测定方法相同。绘制花青素浓度与吸光度关系的标准曲线。

 

6   结果计算

试样中花青素测定结果按下式计算

 

 

式中:  

X试样中花青素的含量,g/100g

    C由标准曲线上查出待测试样中花青素的浓度,μg/mL

    V待测试样定容总体积,mL

    m试样质量,g

计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,保留三位有效数字。 

 

7   精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%

 


八、保健食品中核苷酸的测定

                                                                                 

 

第一法

1   范围

本方法规定了保健食品中核苷酸的超高效液相色谱(UPLC)测定方法。

本方法适用于保健食品中核苷酸的测定。

 

2   原理

将试样溶解、去除蛋白后,超高效液相色谱(UPLC)分离,相对保留时间定性,峰面积定量。

 

3   试剂

注:除特殊说明,所用试剂均为分析纯,实验用水符合GB/T 6682一级水要求。

3.1 乙腈(CH3CN):优级纯。

3.2 乙酸C2H4O2):36%37%g/g)。

3.3 磷酸(H3PO4)。

3.4 磷酸氢二钠(Na2HPO4

3.5 标准品

核苷酸标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1,纯度≥97%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

1:各核苷酸标准品的分子式、相对分子量、CAS登录号

名称

英文名

CAS

分子式

相对分子量

鸟嘌呤核苷

Guanine nucleotideGMP

85-32-5

C10H14N5O8P

363.22

腺嘌呤核苷

Adenine nucleotideAMP

61-19-8

C10H14O7N5P

347.22

次黄嘌呤核苷

Hypoxanthine nucleotideIMP

131-99-7

C10H13N4O8P

348.21

胞嘧啶核苷

Cytosine nucleotideCMP

63-37-6

C9H14N3O8P

323.20

尿嘧啶核苷

Uracil nucleotideUMP

58-97-9

C9H13N2O9P

324.18

3.6 标准溶液配制

3.6.1 核苷酸标准储备液:称取经100℃干燥4h处理的核苷酸标准品(3.5)各50mg(精确至0.1mg),用水溶解,并转移至100mL容量瓶中,定容至刻度,此溶液浓度为0.5mg/mL

3.6.2 核苷酸标准系列工作液:分别准确吸取不同体积的标准储备液(3.6.1),用水将其稀释成核苷酸含量分别为10.0μg/mL20.0μg/mL40.0μg/mL80.0μg/mL100μg/mL的标准系列工作液。临用时配制。

 

4   仪器和设备

4.1 高效液相色谱仪(UPLC):配有二极管阵列检测器或紫外检测器。

4.2 分析天平:感分别为0.1mg0.001g

 

5   分析步骤

5.1 试样制备

5.1.1 不含蛋白试样

称取试样适量于100mL棕色容量瓶中,加入约50℃的热水80mL,彻底混匀,超声30分钟,冷却至室温后用水定容至刻度。过滤,滤液过0.22μm针孔滤膜,超液相色谱仪测定。

5.1.2 含蛋白试样

称取试样适量于100mL棕色容量瓶中,加入约50℃的热水80mL,加入乙酸(3.2100μL,彻底混匀,超声30分钟,冷却至室温后用水定容至刻度。过滤,滤液过0.22μm针孔滤膜,超高效液相色谱仪测定。

5.2 仪器参考条件

色谱柱:BEH Amide2.1mm×100mm1.7μm,或性能相当者。

流动相:A:乙腈、B10mmol/L Na2HPO4水溶液、C0.1%H3PO4水溶液,梯度洗脱。梯度表如下:

 

时间

A%

B%

C%

0.0

88.0

7.0

5.0

6.0

80.0

17.5

2.5

8.0

77.0

22.0

1.0

9.0

65.0

35.0

0.0

10.7

55.0

45.0

0.0

10.8

88.0

7.0

5.0

13.0

88.0

7.0

5.0

 

流速:0.5mL/min

柱温:50℃

检测波长:254nm

进样量:1μL

5.3 标准曲线的制作

将标准系列工作液(3.6.2)分别按液相色谱参考条件(5.2)进行测定,得到相应的核苷酸标准溶液的色谱峰面积,以标准工作液的浓度为横坐标,以色谱峰的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。

5.4 试样溶液的测定

将试样溶液(5.1)按液相色谱参考条件(5.2)进行测定。

 

6   结果计算

试样中核苷酸测定结果按下式计算:

 

 

式中:

X-试样中核苷酸的含量,mg/g

C-由标准曲线得出的试样溶液中核苷酸的浓度,μg/mL

V-试样定容体积,mL

m-试样称取的质量,g

试样中总核苷酸的含量为胞嘧啶核苷(CMP)、尿嘧啶核苷(UMP)、腺嘌呤核苷(AMP)、鸟嘌呤核苷(GMP)、次黄嘌呤核苷(IMP)含量之和。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字。

 

7 精密度

在重复条件下获得的两次测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%

 

第二法

 

1   范围

本方法规定了保健食品中核苷酸的高效液相色谱(HPLC)测定方法。

本方法适用于保健食品中核苷酸的测定。

 

2   原理

将试样溶解、去除蛋白后,高效液相色谱分离,相对保留时间定性,峰面积定量。

 

3   试剂

注:除特殊说明,所用试剂均为分析纯,实验用水符合GB/T 6682-2008一级水要求

3.1 乙腈(CH3CN):优级纯。

3.2 乙酸C2H4O2):36%37%g/g)。

3.3 磷酸(H3PO4)。

3.4 标准品

同方法一。

3.5 标准溶液配制

3.5.1 核苷酸标准储备液:称取经100℃干燥4h处理的核苷酸标准品(3.4)各50mg(精确至0.1mg),用水溶解,并转移至100mL容量瓶中,定容至刻度,此溶液浓度为0.5mg/mL

3.5.2 核苷酸标准系列工作液:分别准确吸取不同体积的标准储备液(3.5.1),用水将其稀释成核苷酸含量分别为10.0μg/mL20.0μg/mL40.0μg/mL80.0μg/mL100μg/mL的标准系列工作液。临用时配制。

 

4   仪器和设备

4.1 液相色谱仪:配有二极管阵列检测器或紫外检测器。

4.2 分析天平:感分别为0.1mg0.001g

5   分析步骤

5.1 试样制备

5.1.1 不含蛋白试样

称取试样适量于100mL棕色容量瓶中,加入约50℃的热水80mL,彻底混匀,超声30分钟,冷却至室温后用水定容至刻度。过滤,滤液过0.45μm针孔滤膜,液相色谱仪测定。

5.1.2 含蛋白试样

称取试样适量于100mL棕色容量瓶中,加入约50℃的热水80mL,加入乙酸(3.2100μL,彻底混匀,超声30分钟,冷却至室温后用水定容至刻度。过滤,滤液过0.45μm针孔滤膜,液相色谱仪测定。

5.2 仪器参考条件

5.2.1 高效液相色谱

色谱柱:C18 250mm×4.6mm5μm,或性能相当者。

流动相:乙腈0.2%H3PO4水溶液=97:3(V/V)

流速:1mL/min

柱温:35℃

检测波长:254nm

进样量:10μL

5.3 标准曲线的制作

将标准系列工作液(3.5.2)分别按液相色谱参考条件(5.2)进行测定,得到相应的核苷酸标准溶液的色谱峰面积,以标准工作液的浓度为横坐标,以色谱峰的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。

5.4 试样溶液的测定

将试样溶液(5.1)按液相色谱参考条件(5.2)进行测定。

 

6   结果计算

试样中核苷酸测定结果按下式计算:

                

 

 

式中:

X-试样中核苷酸的含量,mg/g

C-由标准曲线得出的试样溶液中核苷酸的浓度,μg/mL

V-试样定容体积,mL

m-试样称取的质量,g

试样中总核苷酸的含量为胞嘧啶核苷(CMP)、尿嘧啶核苷(UMP)、腺嘌呤核苷(AMP)、鸟嘌呤核苷(GMP)、次黄嘌呤核苷(IMP)含量之和。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字。

 

7   精密度

在重复条件下获得的两次测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%

 


附录A

标准溶液和试样溶液典型液相色谱图UPLC法)

 

 

A.1 核苷酸的标准溶液色谱图

 

 

 

A.2 核苷酸试样溶液色谱图

G:鸟嘌呤核苷(GMP);A:腺嘌呤核苷(AMP);I:次黄嘌呤核苷(IMP

C:胞嘧啶核苷(CMP);U:尿嘧啶核苷(UMP


附录B 

标准溶液和试样溶液典型液相色谱图HPLC法)

 

 

B.1 核苷酸的标准溶液色谱图

 

 

 

B.2 核苷酸试样溶液色谱图

G:鸟嘌呤核苷(GMP);A:腺嘌呤核苷(AMP);I:次黄嘌呤核苷(IMP

C:胞嘧啶核苷(CMP);U:尿嘧啶核苷(UMP

 


九、保健食品中洛伐他汀的测定

 

范围

本方法规定了保健食品中洛伐他汀的液相色谱测定方法。

本方法适用于以红曲及其加工品为原料的保健食品中内酯(闭环)洛伐他汀及酸式(开环)洛伐他汀的测定。

 

原理

试样经75%乙醇溶液超声提取,采用液相色谱分离内酯(闭环)及酸式(开环)洛伐他汀,紫外检测器检测,以保留时间定性,外标法定量。

 

试剂和材料

:除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为 GB/T 6682规定的一级水。

3.1 试剂

3.1.1 甲醇(CH3OH):色谱纯。

3.1.2 无水乙醇(CH3CH2OH)。

3.1.3 磷酸(H3PO4)

3.1.4 氢氧化钠(NaOH)。

3.1.5 盐酸(HCl):含量:36%~38%

3.2 试剂配制

3.2.1 75%乙醇(v/v):将无水乙醇和水按75+25的体积比混合均匀。

3.2.2 0.2mol/L氢氧化钠溶液:称取氢氧化钠1.6g,加水使溶解成200mL,即得。

3.2.3 0.2mol/L盐酸溶液:吸取盐酸1.8mL,加水适量使成100mL,即得。

3.3 标准品

洛伐他汀标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1,纯度≥98%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质

1 洛伐他汀标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

洛伐他汀

Lovastatin

75330-75-5

C24H36O5

404.54

3.4 标准溶液配制

3.4.1 洛伐他汀标准储备液(400μg/mL):准确称取洛伐他汀标准品40mg(精确至0.01 mg),用75%乙醇溶解并定容至100mL

3.4.2 洛伐他汀标准系列工作液:用流动相稀释,配制浓度为8.00μg/mL20.0μg/mL40.0μg/mL80.0μg/mL160μg/mL320μg/mL 的系列标准工作液。

3.4.3 定性用酸式(开环)洛伐他汀溶液:称取洛伐他汀(内酯)标准品4mg,用0.2mol/L氢氧化钠溶液定容至100mL,在50℃条件下超声转化1h冷却至室温后再放置1h,用0.2mol/L 盐酸溶液调节pH至中性。

 

仪器和设备

4.1 高效液相色谱仪:配有二极管阵列或紫外检测器(UV)。

4.2 分析天平:感量为0.01mg0.0001g

4.3 超声波清洗器,功率≥250W

4.4 涡旋混合器。

4.5 离心机:转速≥3500 r/min

 

分析步骤

5.1 试样制备

取片剂、颗粒剂等固体样品适量,研磨均匀;胶囊剂、软胶囊剂取内容物,研磨或混匀。称取上述混匀的试样适量(相当于含洛伐他汀约5mg),精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50mL 75%乙醇,密塞,称定重量,超声提取(功率250W,频率33kHz60min,放冷,再称定重量,用75%乙醇补足减失的重量,摇匀,以3500r/min的转速离心10min,取上清液,经0.45μm微孔滤膜过滤,滤液作为试样待测液。

5.2 仪器参考条件

5.2.1 色谱柱:C18柱,250mm×4.6mm 5μm或同等性能色谱柱。

5.2.2 柱温:25℃

5.2.3 检测波长:238nm

5.2.4 流动相:甲醇++磷酸=385+115+0.14

5.2.5 流速:1.0mL/min

5.2.6 进样量:10μL

5.3 标准曲线的制作

将标准系列工作液分别注入液相色谱仪中,测得相应的峰面积,以标准系列工作液的浓度(μg/mL)为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。

5.4 试样溶液的测定

将试样待测液注入液相色谱仪中,以保留时间定性,测定内酯型(闭环)洛伐他汀或酸式(开环)洛伐他汀峰面积,分别代入内酯型(闭环)洛伐他汀标准曲线计算,得到待测液中内酯型(闭环)洛伐他汀或酸式(开环)洛伐他汀的浓度(μg/mL)。

 

结果计算

6.1 试样中内酯型(闭环)洛伐他汀或酸式(开环)洛伐他汀的含量分别按下式计算:

 

式中:

Xi试样中内酯型(闭环)洛伐他汀或酸式(开环)洛伐他汀的含量,单位为克每百克(g/100g); 

Ci被测定样液中内酯型(闭环)洛伐他汀或酸式(开环)洛伐他汀的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);

V被测定样液的最终定容体积,单位为毫升(mL);

m—试样的称样质量,单位为克(g);

100单位转换;

1000单位转换。

6.2 试样中洛伐他汀的总含量按下式计算:

式中:

X试样中洛伐他汀的总含量,单位为克每百克(g/100g);

X1试样中内酯型(闭环)洛伐他汀的含量,单位为克每百克(g/100g);

X2试样中酸式(开环)洛伐他汀的含量,单位为克每百克(g/100g);

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字。

 

精密度

在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%


附录A

标准溶液和试样溶液典型液相色谱图

 

 

A.1  内酯型(闭环)洛伐他汀标准溶液色谱图

 

 

A.2  酸式(开环)洛伐他汀标准溶液色谱图

 

  

A.3  含有洛伐他汀的试样溶液色谱图

 


十、保健食品中槲皮素、山柰素、异鼠李素的测定

 

范围

本方法规定了保健食品中槲皮素、山柰素、异鼠李素的液相色谱测定方法。

本方法适用于以银杏叶或银杏叶提取物为主要原料的保健食品中槲皮素、山柰素、异鼠李素的测定。

 

原理

试样经甲醇提取、水解等前处理后,采用液相色谱分离、紫外检测器检测,以保留时间定性,以外标法定量。

 

试剂和材料

:除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为 GB/T 6682规定的一级水。

3.1 试剂

3.1.1 甲醇(CH3OH):色谱纯。

3.1.2 磷酸(H3PO4)。

3.1.3 盐酸(HCl):含量:36%~38%

3.2 试剂配制

3.2.1 盐酸溶液(3.0mol/L):取盐酸25mL,加水适量使成100mL,摇匀。

3.2.2 80%甲醇溶液:将甲醇和水按80+20的体积比混合均匀。

3.3 标准品

槲皮素、山柰素、异鼠李素标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1,纯度≥98%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质

1标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

槲皮素

Quercetin

117-39-5

C15H10O7

302.24

山柰素

Kaempferol

520-18-3

C15H10O6

286.23

异鼠李素

Isorhamnetin

480-19-3

C16H12O7

316.27

3.4 标准溶液配制

3.4.1 标准储备液(1mg/mL):分别准确称取槲皮素、山柰素、异鼠李素标准品100mg(准确至0.1mg),于100mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度。

3.4.2 槲皮素、山柰素、异鼠李素混合标准中间液(200μg/mL):分别准确吸取槲皮素、山柰素、异鼠李素标准储备液各5.00mL25mL容量瓶中,用流动相定容。

3.4.3 混合标准系列工作液:分别准确吸取槲皮素、山柰素、异鼠李素混合标准中间液0.50mL1.00mL2.00mL3.00mL5.00mL10mL容量瓶中,用流动相定容至刻度,配制成质量浓度分别为10.0μg/mL20.0μg/mL40.0μg/mL60.0μg/mL100μg/mL的混合标准系列工作液。

 

仪器和设备

4.1 高效液相色谱仪:配有二极管阵列或紫外检测器(UV)。

4.2 分析天平:感量为0.01mg0.0001g

4.3 超声波清洗器:功率≥250W

4.4 水浴锅。

 

分析步骤

5.1 试样制备

取片剂、颗粒剂等固体样品适量,研磨均匀;胶囊剂、软胶囊剂取内容物,研磨混匀。

5.1.1 槲皮素、山柰素、异鼠李素的测定

精密称取试样适量(相当于含槲皮素、山柰素、异鼠李素总量约3mg),加20mL甲醇,超声提取(功率250W,频率33kHz30min,滤过,残渣用甲醇约5mL洗涤,洗液并入滤液,加入15mL盐酸溶液(3.0mol/L),水浴回流水解3h,冷却,转移至50mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,混匀,经0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液,作为试样待测液。

5.1.2 游离槲皮素、山柰素、异鼠李素的测定

精密称取试样适量(相当于含槲皮素、山柰素、异鼠李素总量约3mg),置具塞锥形瓶中,精密加入80%甲醇溶液20mL,密塞,称定重量,超声提取(功率250W,频率33kHz20min,取出,放冷,再称定重量,用80%甲醇溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,作为试样待测液。

5.2 仪器参考条件

5.2.1 色谱柱:C18柱, 150mm ×3.9mm 5μm或同等性能色谱柱。

5.2.2 柱温:25℃ 

5.2.3 检测波长:360nm

5.2.4 流动相:甲醇+0.4%磷酸溶液=50+50

5.2.5 流速:1.0mL/min

5.2.6 进样量:10μL

5.3 标准曲线的制作

10μL的混合标准系列工作液分别注入液相色谱仪中,测得相应的峰面积,以标准工作液的浓度(μg/mL)为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。

5.4 试样溶液的测定

10μL试样待测液(5.1.1)注入液相色谱仪中,以保留时间定性,测得峰面积,根据标准曲线得到待测液中槲皮素、山柰素、异鼠李素的浓度(μg/mL);将10μL试样待测液(5.1.2)注入液相色谱仪中,以保留时间定性,测得峰面积,根据标准曲线得到待测液中游离槲皮素、山柰素、异鼠李素的浓度(μg/mL)。

 

结果计算

6.1 试样中槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量分别按下式计算:

 

式中:

Xi—试样中槲皮素或山柰素或异鼠李素的含量,单位为克每百克(g/100g); 

Ci被测定样液中槲皮素或山柰素或异鼠李素的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);

V被测定样液的最终定容体积,单位为毫升(mL);

m—试样的称样质量,单位为克(g);

100单位转换;

1000单位转换。

6.2 试样中槲皮素、山柰素、异鼠李素的总含量按下式计算:

 

 

式中:

X试样中槲皮素、山柰素、异鼠李素的总含量,单位为克每百克(g/100g);

X1试样中槲皮素的含量,单位为克每百克(g/100g);

X2试样中山柰素的含量,单位为克每百克(g/100g);

X3试样中异鼠李素的含量,单位为克每百克(g/100g);

6.3 试样中银杏叶总黄酮醇苷的含量按下式计算:

 

 

式中:

Y试样中银杏叶总黄酮醇苷的含量,单位为克每百克(g/100g);

X试样中槲皮素、山柰素、异鼠李素的总含量,单位为克每百克(g/100g);

2.51—换算因子。

6.4 试样中游离槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量分别按下式计算:

 

式中:

Xi试样中游离槲皮素或游离山柰素或游离异鼠李素的含量,单位为毫克每克(mg/g);

Ci被测定样液中游离槲皮素或游离山柰素或游离异鼠李素的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);

V被测定样液的最终定容体积,单位为毫升(mL);

m试样的称样质量,单位为克(g);

1000—单位转换。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字。

 

精密度

在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%


附录A

标准溶液和试样溶液典型液相色谱图

 

 

A.1  槲皮素、山柰素、异鼠李素标准溶液色谱图

 

 

 

A.2  含槲皮素、山柰素、异鼠李素的试样溶液色谱图

 


十一、保健食品中茶氨酸的测定

 

1  范围

本方法规定了保健食品中茶氨酸的高效液相色谱测定方法。

本方法适用于红茶、绿茶等及以茶氨酸为主要原料的保健食品中茶氨酸含量的测定。

 

2   原理

试样经水提取,使用等度洗脱,采用配有二极管阵列检测器或紫外检测器的高效液相色谱仪检测,以保留时间定性,外标法定量。

 

3   试剂和材料

:水为GB/T 6682规定的一级水。

3.1 试剂

3.1.1 三氟乙酸CF3COOH,色谱纯。

3.2 标准品

茶氨酸标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1,纯度≥98%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质

1 茶氨酸标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

茶氨酸

L-theanine

3081-61-6

C7H14N2O3

174.20

3.3 标准溶液配制

3.3.1 茶氨酸标准储备液:称取35.0mg茶氨酸标准品(精确到0.1mg),用水溶解后,移入10mL容量瓶,用水定容至刻度,此溶液浓度为3.5mg/mL。贮存于4℃冰箱中,有效期3个月。

3.3.2 茶氨酸标准系列工作液:分别准确吸取茶氨酸标准储备液(3.3.10.2mL0.4mL0.6mL0.8mL1.0mL,移入10mL容量瓶,用水定容至刻度。得到浓度分别为0.070mg/mL0.14mg/mL0.21mg/mL0.28mg/mL0.35mg/mL茶氨酸标准使用液。临用时配制。

3.4 三氟乙酸水溶液:取水加三氟乙酸(3.1.1),调至pH3.0,经微孔滤膜(3.5)过滤,待用。

3.5 微孔滤膜:0.45μm,水相。

 

4   仪器和设备

4.1 高效液相色谱仪:配有二极管阵列检测器或紫外检测器。

4.2 恒温水浴锅。

4.3 离心机:转速≥8000r/min

4.4 分析天平:感量分别为0.0001g0.001g

4.5 pH计。

 

5   分析步骤

5.1 试样制备

5.1.1 固体试样的处理:称取粉碎试样适量(精确至0.001g,相当于含茶氨酸10mg),加水30mL,在80℃的恒温水浴锅上加热40min,冷却,离心,过滤后,转移至50mL容量瓶,用水定容至刻度,混匀。试样溶液经微孔滤膜(3.5)过滤,滤液进液相色谱仪分析。

5.1.2 液体试样的处理:取一定量的试样在水浴锅上蒸干,残渣用水溶解,转移至10mL容量瓶,用水定容至刻度,混匀。试样溶液经微孔滤膜(3.5)过滤,滤液进液相色谱仪分析。

5.2 仪器参考条件

5.2.1 色谱柱:C18柱, 250mm×4.6mm 5μm或性能相当者。

5.2.2 流动相:三氟乙酸水溶液(3.4)。

5.2.3 流速:1.0mL/min

5.2.4 柱温:35℃

5.2.5 检测波长:203nm

5.2.6 进样量:10μL

5.3 标准曲线的制作

将标准系列工作液(3.3.2)分别按液相色谱参考条件(5.2)进行测定,得到相应的茶氨酸标准溶液的色谱峰面积(峰高),以标准工作液的浓度为横坐标,以色谱峰的峰面积(峰高)为纵坐标,绘制标准曲线。

5.4 试样溶液的测定

将试样溶液(5.1)按液相色谱参考条件(5.2)进行测定,得到相应的样品溶液茶氨酸的色谱峰面积(峰高),根据标准曲线得到待测液中茶氨酸的浓度,平行测定次数不少于两次。

茶氨酸的标准液相色谱图参见附录A的图A.1

6   结果计算

试样中茶氨酸含量按下式计算:

式中:

X试样中茶氨酸的含量,单位为克每百克(g/100g);

C由标准曲线得出的样液中茶氨酸的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL);

V试样提取过程中定容体积,单位为毫升(mL);

m试样称取的质量,单位为克(g);

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字。

 

7   精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%


附录A

 

茶氨酸的高效液相色谱图

 

 

 

 

 

 

 

 

 

A.1茶氨酸的高效液相色谱图

 

 


十二、保健食品中五味子醇甲、五味子甲素和乙素的测定

                                                                                   

 

1   范围

本方法规定了保健食品中五味子醇甲、五味子甲素和乙素的高效液相色谱测定方法。

本方法适用于以五味子为主要原料生产的保健食品中五味子醇甲、五味子甲素和乙素含量的测定。

 

2   原理

将试样中的五味子醇甲、五味子甲素和乙素经甲醇提取后,使用等度洗脱反相高效液相色谱进行分离,二极管阵列检测器检测,根据色谱峰的保留时间和紫外光谱图定性,外标法定量。

 

3  试剂和材料

除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。

3.1 试剂

3.1.1 甲醇(CH3OH):色谱纯。

3.1.2 甲醇(CH3OH)。

3.2 标准品

五味子醇甲、五味子甲素和乙素标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1,纯度≥98%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质

1 五味子醇甲、五味子甲素和乙素标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

五味子醇甲

Schisandrin

7432-28-2

C24H32O7

432.51

五味子甲素

Deoxyschisandrin

61281-38-7

C24H32O6

416.51

五味子乙素

Schisandrin B

61281-37-6

C23H28O6

400.46

3.3 标准溶液配制

3.3.1 五味子醇甲、五味子甲素和乙素混合标准储备液:分别准确称取五味子醇甲、五味子甲素和乙素标准样品(3.220mg(精确至0.01mg),用甲醇溶解,并转移至10mL容量瓶中,定容至刻度,溶液浓度分别为2mg/mL

3.3.2 五味子醇甲、五味子甲素和乙素混合标准系列工作液:分别准确吸取不同体积的混合标准储备液(3.3.1),用甲醇将其稀释成含量分别为0.020mg/mL0.050mg/mL0.20mg/mL0.50mg/mL1.0mg/mL的标准系列工作液。

 

4  仪器和设备

4.1 高效液相色谱仪:配有二极管阵列检测器。

4.2 超声波清洗器。

4.3 分析天平:感量分别为0.01mg0.001g

 

5  分析步骤

5.1 试样制备

准确称取粉碎后样品适量(相当于含五味子总量30mg,精确至0.001g),置20mL容量瓶中,加入甲醇(3.1.2)约18mL,超声提取20min,取出,静置待冷,加甲醇至刻度。试样溶液过0.45μm有机系滤膜,滤液进行液相色谱分析。

5.2 仪器参考条件

5.2.1 色谱柱:C18柱,250mm×4.6mm5μm,或同等性能色谱柱。

5.2.2 检测波长:254nm

5.2.3 流动相:甲醇3.1.1+水,(77+23v/v)。

5.2.4 流速:1.0mL/min

5.2.5 柱温:35℃

5.2.6 进样量:10μL

5.3 标准曲线的制作

将标准系列工作液(3.3.2)分别按液相色谱参考条件(5.2)进行测定,以标准工作液的浓度为横坐标,以色谱峰的峰面积为纵坐标,绘制五味子醇甲、五味子甲素和乙素的标准曲线。

5.4 试样溶液的测定

将试样溶液(5.1)按液相色谱参考条件(5.2)进行测定,以保留时间和紫外光谱图定性,用相应样品溶液五味子醇甲、五味子甲素和乙素的色谱峰面积,根据标准曲线得到待测液中五味子醇甲、五味子甲素和乙素的浓度,平行测定次数不少于两次。

五味子醇甲、五味子甲素和乙素的标准液相色谱图参见附录A的图A.1

 

6   结果计算

试样中五味子醇甲、五味子甲素和乙素的含量按下式计算:

 

式中:

X试样中五味子醇甲、五味子甲素和乙素的含量,单位为毫克每一百克(mg/100g);

    C试样溶液中五味子醇甲、五味子甲素和乙素的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL);

    V试样定容体积,单位为毫升(mL);

    m试样质量,单位为克(g)。

计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,保留三位有效数字。

 

7   精密度

在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%

 

 


附录A

 

五味子醇甲、五味子甲素和乙素的高效液相色谱图

 

 

 

A.1五味子醇甲、五味子甲素和乙素的高效液相色谱图

1为五味子醇甲2为五味子甲素3为五味子乙素

 

 


十三、保健食品中腺苷的测定

 

1   范围

本方法规定了保健食品中腺苷的高效液相色谱测定方法。

本方法适用于保健食品中腺苷的含量测定。

 

2   原理

试样经水超声提取,用高效液相色谱仪进行测定,以保留时间定性,峰面积外标法定量。

 

3   试剂和材料

除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。

3.1 试剂

3.1.1 磷酸二氢钾(KH2PO4)。

3.1.2 甲醇(CH3OH):色谱纯。

3.1.3 硅藻土(SiO2):化学纯,粒径范围:0.2-0.8mm

3.2 标准品

腺苷标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1,纯度≥98%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质

1腺苷标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

腺苷

Adenosine

58-61-7

C10H13N5O4

267.24

3.3 标准溶液配制

3.3.1 腺苷标准储备液:称取10mg (准确至0.01mg)腺苷标准品(3.2)于10mL 容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,摇匀。此溶液浓度为1.0mg/mL

3.3.2 腺苷标准中间液:准确吸取腺苷标准储备液(3.3.12.5mL25mL容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀。此溶液浓度为100μg/mL

3.3.3 腺苷标准系列工作液:分别准确吸取腺苷标准中间液(3.3.20.1mL0.2mL0.5mL1.0mL2.0mL5.0mL10mL容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,得浓度分别为1.0μg/mL2.0μg/mL5.0μg/mL10μg/mL20μg/mL50μg/mL的标准系列工作液。临用时配制。

3.4 磷酸二氢钾溶液(0.01mol/L):称取1.36g磷酸二氢钾(3.1.1),加水溶解并稀释至1000mL经微孔滤膜(3.5)过滤,待用。

3.5 微孔滤膜:0.45μm,水相。

 

4   仪器和设备

4.1 高效液相色谱仪:配有二极管阵列检测器或紫外检测器。

4.2 超声波提取器:功率250W,频率33kHz

4.3 分析天平:感量0.01mg0.0001g0.001g

4.4 离心机:转速≥3000 r/min

 

5   分析步骤

5.1 试样制备

5.1.1 试样提取

5.1.1.1 固体试样

准确称取粉碎并混合均匀的试样0.5g~2g(精确至0.0001g,含待测组分约0.05mg ~2.5mg50mL容量瓶中,加入水约30mL,超声提取20min,放至室温,用水稀释至刻度,摇匀,3000 r/min离心5min再经微孔滤膜(3.5)过滤,取续滤液进液相色谱仪分析。

5.1.1.2 软胶囊试样

取软胶囊剪开,挤出内容物并混匀,准确称取2g(精确至0.0001g),准确加入等量硅藻土(3.1.3),研至分散均匀,准确称取其中部分(准确至0.0001g,含待测组分约0.05mg ~2.5mg),转移至250mL具塞三角瓶中,并吸取50.0mL水,并入三角瓶中,称重(准确至0.001g,加塞超声提取20min,放至室温,用水补足重量,摇匀,静置澄清或以3000r/min离心5min。取上清液,再经微孔滤膜(3.5)过滤,取续滤液进液相色谱仪分析。

5.1.1.3 液体试样

准确吸取混匀的试样5.0mL~10.0mL含待测组分约0.05mg ~2.5mg)于50mL容量瓶中,加入水约30mL,超声提取20min,放至室温,用水稀释至刻度,摇匀,以3000r/min离心5min。再经微孔滤膜(3.5)过滤,取续滤液进液相色谱仪分析。

5.1.2 试样溶液稀释

必要时,根据上述试样溶液中腺苷的含量,用水进行适当的稀释(稀释倍数F),使待测溶液中腺苷浓度在1.0μg/mL~50μg/mL范围内。

5.2 仪器参考条件

5.2.1 色谱柱:C18柱, 250mm×4.6mm 5μm,或性能相当者。

5.2.2 流动相:甲醇(3.1.2+磷酸二氢钾溶液(3.4),(10+90v/v)。

5.2.3 流速:1.0mL/min

5.2.4 柱温:35℃

5.2.5 检测波长:254nm

5.2.6 进样量:10μL

5.3 标准曲线的制作

将标准系列工作液(3.3.3)分别按液相色谱参考条件(5.2)进行测定,得到相应的腺苷标准溶液的色谱峰面积,以标准系列工作液的浓度为横坐标,以色谱峰的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。

5.4 试样溶液的测定

将待测溶液(5.1)按液相色谱参考条件(5.2)进行测定,得到相应的待测溶液腺苷的色谱峰面积,根据标准曲线得到待测液中腺苷的浓度,平行测定次数不少于两次。

腺苷的标准液相色谱图参见附录A的图A.1

 

6   结果计算

试样中腺苷含量按下式计算:

 

式中

X试样中腺苷的含量,固体和软胶囊试样的单位为毫克每百克(mg/100g),液体试样的单位为毫克每百毫升(mg/100mL);

C根据标准曲线计算得到的待测溶液中腺苷的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);

V试样提取时的定容体积,单位为毫升(mL);

F稀释倍数;

m试样称取的质量,单位为克(g);或液体试样吸取的体积,单位为毫升(mL);

100—单位转换;

1000—单位转换。

计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字。

 

7   精密度

在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%


附录A

 

腺苷的高效液相色谱图

 

 

A.1腺苷的高效液相色谱图

 

 

 

 

 


十四、保健食品中总皂苷的测定

 

1   范围

方法规定了保健食品中总皂苷的分光光度测定方法。

方法适用于含五加科原料保健食品中总皂苷含量的测定。

 

第一法

2   原理

试样用水提取总皂苷类成分,过大孔树脂柱除杂后,试样中的皂苷类成分在高氯酸的作用下与香草醛反应,产生特征的紫红色,采用分光光度法测定560nm波长处的吸光度,进行定量。

 

3   试剂和材料

注:除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为 GB/T 6682 规定的一级水。

3.1 试剂

3.1.1 Amberlite-XAD-2 大孔树脂(D-101大孔树脂):2060目,使用前应按照使用说明书进行活化处理。

3.1.2 中性氧化铝:层析用(100-200目)。

3.1.3 无水乙醇(CH3CH2OH)。

3.1.4 甲醇(CH3OH)。

3.1.5 高氯酸(HClO4)。

3.1.6 冰乙酸(CH3COOH)。

3.1.7 香草醛(C8H8O3)。

3.2 标准品

人参皂苷Re标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质

1 人参皂苷Re标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

人参皂苷Re

Ginsenoside Re

52286-59-6

C48H82O18

947.15

3.3 标准溶液配制

人参皂苷Re标准储备液(0.2mg/mL):准确称取人参皂苷Re标准样品3.210mg(精确至0.01mg)于50mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀。

3.4 试剂配制

3.4.1 70%乙醇:取无水乙醇70mL,加水使成100mL,混匀。

3.4.2 香草醛溶液:称取5g香草醛,加冰乙酸溶解并定容至100mL,混匀。

 

4   仪器和设备

4.1  紫外/可见分光光度计。

4.2  天平:感量分别为0.01mg0.001g

4.3  超声波清洗器。

4.4  恒温水浴锅。

 

5   分析步骤

5.1 试样制备

5.1.1 试样处理

5.1.1.1 固体试样

称取已粉碎混合均匀的待测试样1g(精确至0.001g)(或根据试样含总皂苷量定),置于具塞锥形瓶中,加入水100.0mL,称重,超声30min,放冷,再用水补足减失重量,摇匀,放置,滤过,续滤液备用。

5.1.1.2 液体试样

含乙醇的液体试样,吸取混合均匀的待测试样10.0mL(或根据试样含总皂苷量定)置水浴上挥尽乙醇后,用水转移至10mL容量瓶中,并用水稀释至刻度,备用;非乙醇类的液体试样,直接取样。

5.1.2 柱层析法

在内径为1.5cm的玻璃层析柱内装3cm已活化的大孔树脂(3.1.1),上加1cm中性氧化铝(3.1.2)。先用25mL70%乙醇(3.4.1)洗柱,弃去洗脱液,再用约25mL水洗脱至无醇味,弃去洗脱液,加入1.0mL已处理好的试样溶液(5.1.1),用25mL水洗脱,弃去洗脱液,再用25mL 70%乙醇(3.4.1)以不超过3mL/min的速度洗脱人参皂苷至洗脱液无色,收集洗脱液于蒸发皿中,置于60℃水浴挥干,残渣用少量甲醇(3.1.4)溶解并转移至10mL具塞比色管中,备用。

5.2 标准曲线的制作

吸取人参皂苷Re标准溶液(3.30.0mL0.4mL0.6mL0.8mL1.0mL1.2mL10mL具塞比色管中,置水浴中挥干溶剂,加入0.2mL香草醛溶液(3.4.2),再加入0.8mL高氯酸(3.1.5),混匀,使残渣全部溶解,置60℃水浴中加热10min,取出,冰浴冷却后,加入5.0mL冰乙酸(3.1.6),摇匀后,以相应试剂为空白,立即于560nm波长处测定吸光度。

5.3 试样溶液的测定

5.1.2项下备用溶液 ,从5.2置水浴中挥干溶剂……”起,与标准溶液同法测定吸光度。

 

6   结果计算

试样中总皂苷含量(以人参皂苷Re计)按下式计算:

 

式中:

Xi试样中总皂苷的含量(以人参皂苷Re计),单位为毫克每百克(mg/100g)或毫克每百毫升(mg/100mL);

Ci由标准曲线算得被测液中人参皂苷Re质量,单位为毫克(mg) ;

V被测样品的稀释体积,单位为毫升(mL);

V0用于柱层析的样液体积,单位为毫升(mL);

m试样取样量,单位为克(g)或毫升(mL);

100—单位转换。

计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,保留三位有效数字。

 

7  精密度

在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%

 

第二法

8  原理

试样用水提取总皂苷类成分,经水饱和正丁醇萃取除杂后,试样中的皂苷类成分在高氯酸的作用下与香草醛反应,产生特征的紫红色,采用分光光度法测定560nm波长处的吸光度,进行定量。

 

9  试剂和材料

注:除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为 GB/T 6682 规定的一级水

9.1  试剂

9.1.1  甲醇(CH3OH)。

9.1.2  石油醚:沸程(6090℃)。

9.1.3  正丁醇(CH3(CH2)2CH2OH)。

9.1.4  无水乙醇(CH3CH2OH)。

9.1.5  氨水(NH3.H2O)。

9.1.6  高氯酸(HClO4)。

9.1.7  冰乙酸 (CH3COOH)。

9.1.8  香草醛(C8H8O3)。

9.2 标准品

人参皂苷Re标准样品:同3.2

9.3 标准溶液配制

人参皂苷Re标准储备液(0.2 mg/mL):同3.3

9.4 试剂配制

9.4.1  香草醛溶液:3.4.2

9.4.2  水饱和正丁醇溶液:取正丁醇适量,加入适量水,充分振摇,静置使分层,上层液体即为水饱和正丁醇。

9.4.3  氨试液:取氨水40mL,加水使成100mL,混匀。

 

10  仪器和设备

10.1  紫外/可见分光光度计。

10.2  天平:感量为0.01mg0.001g

10.3  超声波清洗器。

10.4  离心机:转速 ≥4000r/min。  

10.5  恒温水浴锅。

 

11  分析步骤

11.1 试样制备

11.1.1 试样处理

11.1.1.1 固体试样

称取已粉碎混合均匀的待测试样1g(精确至0.001g)(或根据试样含总皂苷量定),置于具塞锥形瓶中,加入水100.0mL,称重,超声30min,放冷,再用水补足减失重量,摇匀,放置,滤过,续滤液备用。

11.1.1.2 液体试样

含乙醇的液体试样,吸取混合均匀的待测试样10.0mL(或根据试样含总皂苷量定)置水浴上挥尽乙醇后,用水转移至10mL容量瓶中,并用水稀释至刻度,备用;非乙醇类的液体试样,直接取样。

11.1.1.3 含油基质试样

称取已混合均匀的待测试样0.5g(或根据试样含总皂苷量定)置于100mL离心管中,加入20mL石油醚(9.1.2),涡旋混合1min4000r/min离心5min,弃去上清液,残渣挥干石油醚后,加入水50.0mL,称重,超声30min,放冷,再用水补足减失重量,摇匀,放置,滤过,续滤液备用。

11.1.2 萃取除杂

11.1.1.111.1.1.3项下备用溶液25.0mL置分液漏斗中;或将11.1.1.2项下备用溶液用水全部转移至分液漏斗中(非乙醇类液体试样直接取10.0mL)并加水至约25mL。加入20mL水饱和正丁醇(9.4.2)振摇萃取,分取正丁醇液(必要时可离心),重复操作3次,合并正丁醇液用20mL氨试液(9.4.3)洗涤,重复操作2次,弃去氨试液,以适宜方式(水浴、减压或氮吹)除去正丁醇液后,残渣用甲醇(9.1.1)溶解并转移至25mL量瓶中(液体样品则转移至10mL量瓶中),加甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,备用。

11.2 标准曲线的制作

吸取人参皂苷Re标准溶液(9.30.0mL0.4mL0.6mL0.8mL1.0mL1.2mL10mL具塞比色管中,置水浴中挥干溶剂,加入0.2mL香草醛溶液(9.4.1),再加入0.8mL高氯酸(9.1.6),混匀,使残渣全部溶解,置60℃水浴中加热10min,取出,冰浴冷却后,加入5.0mL冰乙酸(9.1.7),摇匀后,以相应试剂为空白,立即于560nm波长处测定吸光度。

11.3 试样溶液的测定

11.1.2项下备用溶液1.0mL10mL具塞比色管中,从11.2 “置水浴中挥干溶剂……”起,与标准溶液同法测定吸光度。

11.4 背景校正(如样品不存在背景干扰,无需校正)

吸取11.1.2项下备用溶液1.0mL10mL具塞比色管中,置水浴中挥干溶剂,加入0.2mL冰乙酸(9.1.7),从11.2 “再精密加入0.8 mL高氯酸(9.1.6……”起,与试样同法测定吸光度,做试样背景校正。

 

12   结果计算

试样中总皂苷含量(以人参皂苷Re计)按下式计算:

 

式中:

Xi试样中总皂苷的含量(以人参皂苷Re计),单位为毫克每百克(mg/100g)或毫克每百毫升(mg/100mL);

Ci经试样背景校正后,由标准曲线算得被测液中人参皂苷Re质量,单位为毫克(mg) ;

V被测样品的稀释体积,单位为毫升(mL);

V0用于显色的样液体积,单位为毫升(mL);

m试样取样量,单位为克(g)或毫升(mL);

100—单位转换。

计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,保留三位有效数字。

 

13   精密度

    在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%

 

 

 

 

 

 


十五、保健食品中总黄酮的测定

                                                                                

范围

方法规定了保健食品中总黄酮的分光光度测定方法。

本方法适用于以含黄酮类成分为主要原料的保健食品中总黄酮含量的测定。

 

第一法

原理

试样中的总黄酮经乙醇提取、聚酰胺粉吸附、甲苯和甲醇洗脱净化后,以芦丁为对照样品,采用分光光度法在360nm波长下测定总黄酮的吸光度,标准曲线法进行定量。

 

试剂和材料

注:除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的二级水或三级水。

3.1 试剂

3.1.1乙醇(C2H5OH)。

3.1.2聚酰胺粉。

3.1.3甲苯(C7H8)。

3.1.4甲醇CH3OH)。

3.2 标准品

芦丁标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1,纯度≥90%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质

1 芦丁标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

芦丁

Rutoside

153-18-4

C27H30O16

610.52

3.3 标准溶液配制

3.3.1芦丁标准储备液:称取在102烘箱中恒重后的芦丁标准样品3.25.0mg(精确至0.01mg,加甲醇溶解,并转移至100mL容量瓶中定容至刻度,此溶液浓度50μg/mL

3.3.2芦丁标准系列工作液:精密吸取0.01.02.03.04.05.0mL的标准储备液(3.3.1),分别置于10mL容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,制成芦丁浓度分别为0.0μg/mL5.0μg/mL10μg/mL15μg/mL20μg/mL25μg/mL的标准系列工作液。

 

仪器和设备

4.1 紫外/可见分光光度计。

4.2 超声波清洗器。

4.3 层析柱。

4.4 分析天平:感量分别为0.01mg0.0001g0.001g

 

分析步骤

5.1 试样制备

称取一定量的试样,加乙醇(3.1.1)定容至25mL,摇匀,超声提取20min,放置,吸取上清液1.0mL,于蒸发皿中,加1g聚酰胺粉(3.1.2)吸附,水浴挥去乙醇,然后转入层析柱层析柱内径可根据每个产品具体情况确定先用20mL甲苯(3.1.3)洗脱,弃去甲苯液;然后用甲醇(3.1.4)洗脱,合并洗脱液并定容至25mL,即得。

5.2 标准曲线的制作

取标准系列工作液(3.3.2),于波长360nm测定吸光度,以芦丁标准工作液的浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。

5.3 试样溶液的测定

取试样溶液(5.1),于波长360nm测定吸光度,根据标准曲线得到试样溶液中总黄酮的浓度,平行测定次数不少于两次。

 

结果计算

试样中总黄酮含量按下式计算:

式中:

X试样中总黄酮的含量,以芦丁(C27H30O16)计, 单位为克每一百克或克每一百毫升(g/100gg/100mL);

C试样溶液中总黄酮的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL

V1试样定容体积,单位为毫升(mL

V2吸取试样溶液体积,单位为毫升(mL

V3过柱后定容体积,单位为毫升(mL

M试样取样量,单位为克或毫升(gmL)。

计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,保留三位有效数字。

 

精密度

在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%

 


第二法

原理

试样经预处理除杂后,以甲醇或60%乙醇溶液提取黄酮类成分。试样中的黄酮类成分可被亚硝酸钠还原,与硝酸铝生成络合物,在氢氧化钠溶液碱性条件下开环,生成2-羟基查尔酮而使溶液显特征的橙红色,采用分光光度法在510nm波长处测定吸光度,以芦丁为对照品,采用标准曲线法计算样品中总黄酮的含量。

 

试剂和材料

注:除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的二级水或三级水。

9.1 试剂

9.1.1 亚硝酸钠(NaNO2)。

9.1.2 硝酸铝(Al(NO3)3·9H2O)。

9.1.3 氢氧化钠NaOH)。

9.1.4 石油醚(6090℃)

9.1.5 无水乙醇CH3CH2OH)。

9.1.6 甲醇CH3OH)。

9.2 试剂配制

9.2.1 5%亚硝酸钠溶液:称取5.0g亚硝酸钠(9.1.1),加水溶解成100mL

9.2.2 10%硝酸铝溶液:称取硝酸铝(9.1.217.6g,加水溶解成100mL

9.2.3 氢氧化钠试液:称取氢氧化钠(9.1.34.3g,加水溶解成100mL

9.2.4 60%乙醇:量取无水乙醇(9.1.560mL,加水至100mL

9.3 标准品

芦丁标准样品:同3.2

9.4 标准溶液配制

9.4.1 芦丁标准储备液:准确称取102烘箱中恒重后的芦丁标准样品9.320mg(精确至0.01 mg,加甲醇溶解,并转移至100mL容量瓶中,定容至刻度,此溶液浓度0.2mg/mL

 

10 仪器和设备

10.1 紫外/可见分光光度计。

10.2 超声波清洗器。

10.3 离心机。

10.4  索氏提取器。

10.5分析天平:感量分别为0.01mg0.0001g0.001g

 

11 分析步骤

11.1 试样制备

注:试样取样量、供试液取样体积可根据试样中总黄酮的含量适当调整,以保证测定的吸光度值在0.30.7范围内。

11.1.1 含油脂类固体样品与软胶囊:精密称取含油脂类固体样品或软胶囊内容物0.4g,置索氏提取器中,加石油醚(9.1.4)加热回流提取至提取液无色,弃去石油醚液,样渣挥去石油醚,转移至具塞锥形瓶中,精密加甲醇(9.1.625mL,密塞,称定重量,超声处理30min,放冷至室温,称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,离心,取上清液作为供试品溶液。

11.1.2 不含油脂类固体样品:精密称取适量,置于具塞锥形瓶中,精密加甲醇(9.1.625mL,密塞,称定重量,超声处理30min,放冷至室温,称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,离心,取上清液作为供试品溶液。

11.1.3 液体试样:精密吸取供试品2mL,置于25mL容量瓶中,加60%乙醇(9.2.4)溶解并稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。

11.2 标准曲线的制作

精密吸取0.01.02.03.04.05.06.0mL的芦丁标准储备液(9.4.1),分别置于25mL容量瓶中,加水至6mL,加入5%亚硝酸钠溶液(9.2.11mL,摇匀,放置6min,加10%硝酸铝溶液(9.2.21mL,摇匀,放置6min,加氢氧化钠试液(9.2.310mL,摇匀,再加水至刻度,摇匀,放置15min,制成芦丁浓度分别为0.0μg/mL8.0μg/mL16μg/mL24μg/mL32μg/mL40μg/mL48μg/mL的标准系列工作液。0.0mL标准储备液制得的溶剂为空白,在波长510nm处分别测定吸光度值。以吸光度为纵坐标,对照品浓度为横坐标,绘制标准曲线。

11.3 试样溶液的测定

精密吸取供试品溶液(11.12mL,至25mL容量瓶中;照11.2,自加水至6mL起,……,至在510nm波长处测定吸光度,同法操作。从标准曲线上读出供试品溶液中含总黄酮的浓度,计算样品中总黄酮的含量。

 

12 结果计算

试样中总黄酮含量按下式计算:

 

式中:

X试样中总黄酮的含量,以芦丁(C27H30O16)计, 单位为克每一百克或克每一百毫升(g/100gg/100mL);

C标准曲线上读出供试品溶液中总黄酮的浓度单位为毫克每毫升(mg/mL

V1试样定容体积,单位为毫升(mL

V2吸取试样溶液体积,单位为毫升(mL

V3显色定容体积,单位为毫升(mL

M试样取样量,单位为克或毫升(gmL)。

计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字。

 

13 精密度

在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%(固体样品)、10%(液体样品)。

注:样品有颜色时,可采用样品标准添加法,以0号管调零,绘制标准曲线,以消除样品颜色干扰。

 


十六、保健食品中壳聚糖脱乙酰度的测定

 

范围

本方法规定了保健食品中壳聚糖脱乙酰度的碱量法测定方法。

本方法适用于保健食品中壳聚糖脱乙酰度的测定。

 

原理

用盐酸溶液溶解试样,溶液中游离的H+用氢氧化钠标准滴定溶液滴定,以甲基橙-苯胺蓝作指示液,通过消耗的氢氧化钠的量计算试样中氨基的含量,从而得到试样中壳聚糖脱乙酰度。

 

试剂和材料

:水为GB/T 6682规定的一级水。

3.1 试剂配制

3.1.1 盐酸标准滴定溶液:cHCl=0.1mol/L。按照GB/T 601标准要求配制和标定,也可购买市售商品化试剂。

3.1.2 氢氧化钠标准滴定溶液:cNaOH=0.1mol/L。按照GB/T 601标准要求配制和标定,也可购买市售商品化试剂。

3.1.3 甲基橙-苯胺蓝指示液:甲基橙溶液(1g/L)与苯胺蓝溶液(1g/L)以12体积比混合。

 

仪器和设备

分析天平:感量为0.0001g

 

分析步骤

5.1 试样制备

准确称取于105℃±2℃烘干至恒重的试样0.2g,精确至0.0001g,加入30mL盐酸标准滴定溶液,搅拌至完全溶解,加入2~3滴甲基橙-苯胺指示液。

5.2 滴定

用氢氧化钠标准滴定溶液滴定5.1中得到的溶液,滴定使溶液颜色由紫红色变为蓝绿色为止,记录消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积。

 

结果计算

试样中壳聚糖脱乙酰度W按下式计算:

 

式中:

c 1盐酸标准滴定溶液的浓度,单位为摩尔每升(mol/L);

V1加入盐酸标准滴定溶液的体积,单位为毫升(mL);

c 0氢氧化钠标准滴定溶液的浓度,单位为摩尔每升(mol/L);

V0滴定用氢氧化钠标准滴定溶液的体积,单位为毫升(mL);

10-3单位换算系数;

16—氨基的摩尔质量,单位为克每摩尔(g/mol);

m试样中壳聚糖的质量,单位为克(g);

0.0994—理论氨基含量(16/161)。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示。

 

精密度

在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%

 

 

 


十七、保健食品中总蒽醌的测定

 

范围

本方法规定了保健食品中总蒽醌的分光光度测定方法。

本方法适用于保健食品中总蒽醌的测定。

 

原理

试样经酸水解后,以有机溶剂提取总蒽醌,利用羟基蒽醌衍生物在碱性溶液中显红-紫红色反应(Borntrager反应),采用分光光度法,以标准曲线定量检测。

 

试剂和材料

注:除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的三级水。

3.1 试剂

3.1.1 盐酸(HCl):含量:36%~38%

3.1.2 氨水(NH3·H2O)。

3.1.3 二氯甲烷(CH2Cl2)。

3.1.4 氢氧化钠(NaOH)。

3.1.5 甲醇(CH3OH)。

3.2 标准品

1,8-二羟基蒽醌标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1,纯度≥99.0%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质

1  1,8-二羟基蒽醌标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

1,8-二羟基蒽醌

1,8-Dihydroxyanthraquinone

117-10-2

C14H8O4

240.21

3.3 标准溶液配制

1,8-二羟基蒽醌标准溶液:精密称取1,8-二羟基蒽醌标准样品10mg(精确至0.01mg),置25mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成0.4mg/mL的溶液。

3.4 试剂配制

3.4.1 4%氨溶液:取氨水16mL,加水稀释至100mL

3.4.2 10%氢氧化钠溶液:称取氢氧化钠10g,加水溶解并定容至100mL

3.4.3 混合碱溶液:等体积10%氢氧化钠溶液和4%氨溶液混合。

3.4.4 甲醇-盐酸(10:1)混合溶液:取甲醇100mL,加盐酸10mL混合均匀。

 

仪器和设备

4.1 分光光度计

4.2 分析天平:感量分别为0.01mg0.0001g

4.3 恒温水浴锅

4.4 旋转蒸发仪

 

分析步骤

5.1 标准曲线的制作

分别精密吸取1,8-二羟基蒽醌标准溶液0.00mL0.10mL0.20mL0.40mL0.60mL0.80mL1.00mL25mL容量瓶中,加混合碱溶液至刻度,混匀,于暗处放置30分钟。以混合碱溶液为空白,在525nm波长处,分别测定吸光度。以浓度(mg/mL)为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

5.2 试样溶液的测定

精密取混合均匀的待测试样适量(相当于含总蒽醌2mg17mg),置100mL圆底烧瓶中,精密加入甲醇-盐酸(101)混合溶液25mL,称重,在80℃水浴中加热回流30分钟,放冷,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,弃去初滤液,精密量取续滤液15mL至分液漏斗中,加水25mL,用二氯甲烷萃取3次(50mL40mL30mL),合并提取液,并用水洗涤3次,每次40mL,洗涤至中性,弃去水洗液,二氯甲烷层转移至蒸发皿中水浴蒸干,或转移至圆底烧瓶于40℃水浴中减压蒸馏至干,残渣加甲醇使溶解并转移至10mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀。精密量取2mL,置25mL量瓶中,加混合碱溶液至刻度,混匀,作为待测液。该溶液于暗处放置30分钟,以混合碱溶液为空白,在525nm波长处,测定吸光度(如果待测液浑浊,可过滤或离心后测定吸光度)。根据回归方程计算试样中总蒽醌的含量。

 

结果计算

试样中总蒽醌含量按下式计算:

 

       V1×V3×V5×100

X= C×————————

       V2×V4×m

式中:

X——试样中总蒽醌的含量,单位为毫克每百克(mg/100g);

C——由标准曲线查得测定试样中总蒽醌的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL);

V1——试样酸解时的稀释体积(mL);

V2——用二氯甲烷萃取时吸取的酸解液体积(mL);

V3——残渣溶解后的体积(mL);

V4——混合碱显色时吸取的甲醇溶液的体积(mL);

V5——混合碱显色的定容体积(mL);

m——试样的称样质量,单位为克(g);

100——单位转换。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留两位有效数字。

 

精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%

 

 

 


十八、保健食品中10-羟基-2-癸烯酸的测定

 

1   范围

本方法规定了保健食品中10-羟基-2-癸烯酸的高效液相色谱测定方法。

本方法适用于保健食品中10-羟基-2-癸烯酸的含量测定。

 

2   原理

试样经乙醇或甲醇提取后,用高效液相色谱进行测定,以保留时间定性,峰面积外标法定量。

 

3   试剂和材料

注:除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。

3.1 试剂

3.1.1 磷酸(H3PO4)。

3.1.2 盐酸(HCl:含量:36%~38%

3.1.3 甲醇(CH3OH):色谱纯。

3.1.4 无水乙醇(C2H6O)。

3.1.5 硅藻土(SiO2):化学纯,粒径范围:0.2~0.8mm

3.2 标准品

10-羟基-2-癸烯酸标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1,纯度≥98%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质

1 10-羟基-2-癸烯酸标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

10-羟基-2-癸烯酸

10-hydroxy-2-decenoic acid

14113-05-4

C10H18O3

186.25

3.3 标准溶液的配制

3.3.1 10-羟基-2-癸烯酸标准储备液:称取10mg(准确至0.01mg10-羟基-2-癸烯酸标准品(3.2)于10mL 容量瓶中,用无水乙醇(3.1.4溶解并定容至刻度,摇匀。此溶液浓度为1.0 mg/mL

3.3.2 10-羟基-2-癸烯酸标准系列工作液:分别准确吸取10-羟基-2-癸烯酸标准储备液(3.3.10.02mL0.10mL0.20mL0.50mL1.00mL 10.0mL容量瓶中,用无水乙醇(3.1.4)稀释至刻度,摇匀,得浓度分别为2.0μg/mL10.0μg/mL20.0μg/mL50.0μg/mL100μg/mL的标准系列工作液。

3.4 盐酸溶液(0.01mol/L:准确吸取盐酸(3.1.20.9mL,缓慢加入1000mL水,混匀。 

3.5 微孔滤膜:0.45μm,有机相。  

 

4   仪器和设备

4.1 高效液相色谱仪:配有紫外(UV)检测器或二极管阵列(DAD)检测器。

4.2 分析天平:感量分别为0.01mg0.0001g0.001g

4.3 离心机:转速≥3000r/min

4.4 超声波清洗器:功率250W,频率33kHz

 

5   分析步骤

5.1 试样制备

5.1.1 试样提取

5.1.1.1 固体试样

准确称取粉碎并混合均匀的试样0.5g~2g(准确至0.0001g,含待测组分约0.1 mg ~5 mg50mL容量瓶中,吸取盐酸溶液(3.42.0mL,量取无水乙醇(3.1.430mL超声提取20min放至室温,用无水乙醇(3.1.4稀释至刻度,摇匀,3000r/min离心10min。取上清液经0.45μm微孔滤膜(3.5)过滤后,取续滤液供液相色谱分析用。

5.1.1.2 软胶囊试样

软胶囊剪开,挤出内容物并混匀,准确称取2g(准确至0.0001g)后,准确加入等量硅藻土(3.1.5),研至分散均匀,准确称取其中部分(准确至0.0001g,含待测组分约0.1mg~5mg),转移至250mL具塞三角瓶中,分别吸取盐酸溶液(3.42.0mL无水乙醇(3.1.448 mL,并入三角瓶中,称重(准确至0.001g,加塞超声提取20min放至室温,用无水乙醇(3.1.4补足重量,摇匀,静置澄清或取部分混悬液3000r/min离心10min。取上清液经0.45μm微孔滤膜(3.5)过滤后,取续滤液供液相色谱分析用。

5.1.1.3 液体试样

准确吸取混匀的试样5.0mL~10.0mL含待测组分约0.1mg ~5mg)于50mL容量瓶中,加甲醇(3.1.330mL超声提取20min放至室温,用甲醇(3.1.3稀释至刻度,摇匀,3000r/min离心10min。取上清液经0.45μm微孔滤膜(3.5)过滤后,取续滤液供液相色谱分析用。

5.1.2 试样溶液稀释

必要时,根据试样溶液中10-羟基-2-癸烯酸的含量,用相应溶剂进行适当的稀释稀释倍数F,使待测溶液中10-羟基-2-癸烯酸浓度在2.0μg/mL~100.0μg/mL范围内。

5.2  仪器参考条件

5.2.1 色谱柱:C18柱,250mm×4.6mm5μm,或性能相当者。

5.2.2 流动相:甲醇3.1.3++磷酸3.1.1),(55+45+0.2v/v

5.2.3 流速:1.0mL/min

5.2.4 柱温:35℃

5.2.5 检测波长:210nm

5.2.6 进样量:10μL

5.3  标准曲线的制作 

10-羟基-2-癸烯酸标准系列工作液(3.3.2)分别按液相色谱参考条件(5.2)进行测定,得到相应的色谱峰面积。以标准系列工作液的浓度为横坐标,以色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。

10-羟基-2-癸烯酸标准溶液液相色谱图参见附录A中图A.1

5.4 待测溶液的测定

将待测溶液(5.1)按液相色谱参考条件(5.2)进行测定,以保留时间定性,得到待测溶液中10-羟基-2-癸烯酸的色谱峰面积,根据标准曲线计算待测溶液中10-羟基-2-癸烯酸的浓度,平行测定次数不少于两次。

待测溶液液相色谱图参见附录A中图A.2

 

6   结果计算

试样中10-羟基-2-癸烯酸含量按下式计算:

 

 

式中:

X试样中10-羟基-2-癸烯酸的含量,固体和软胶囊试样单位为毫克每百克mg/100g,液体试样为毫克每百毫升mg/100mL);

C根据标准曲线计算得到的待测溶液中10-羟基-2-癸烯酸的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);

V试样提取时的定容体积,单位为毫升(mL);

m试样称取的质量,单位为克(g);或液体试样吸取的体积,单位为毫升(mL);

F稀释倍数;

100—单位换算;

1000—单位换算。

计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,保留三位有效数字。

 

7   精密度

在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%


附录 A

标准溶液和待测溶液典型高效液相色谱图

 

A.1  10-羟基-2-癸烯酸标准溶液色谱图

 

 

A.2  含有10-羟基-2-癸烯酸的待测溶液色谱图


十九、保健食品中绞股蓝皂苷XL IX的测定

 

范围

本方法规定了保健食品中绞股蓝皂苷XL IX的高效液相色谱测定方法。

本方法适用于以绞股蓝及其加工品为主要原料的保健食品中绞股蓝皂苷XL IX含量的测定。

 

原理

试样经甲醇提取后,采用配有二极管阵列检测器或紫外检测器的高效液相色谱仪检测,外标法定量。

 

试剂和材料

注:除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。

3.1 试剂

3.1.1 乙腈(CH3CN):色谱纯。

3.1.2 甲醇(CH3OH):分析纯。

3.2 标准品

绞股蓝皂苷XL IX标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1,纯度≥99%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质

1 绞股蓝皂苷XL IX标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量